臨床生化檢驗(yàn)—修第七章 代謝物酶法分析 肖 () ().ppt

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1、第七章代謝物酶法分析技術(shù)廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院臨床生物化學(xué)教研室肖洪廣教學(xué)目標(biāo)與要求掌握：代謝物酶法分析的概念，平衡法和速率法的測(cè)定的理論基礎(chǔ)，脫氫酶指示系統(tǒng)和過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)及酶循環(huán)法測(cè)定的方法原理與評(píng)價(jià)熟悉：酶激活和酶抑制測(cè)定法方法原理與評(píng)價(jià)了解：試劑酶的質(zhì)量要求，代謝物酶法分析技術(shù)的發(fā)展前景代謝物酶法分析技術(shù)的原理1單酶反應(yīng)直接法2酶偶聯(lián)法3酶循環(huán)測(cè)定法4酶激活與酶抑制測(cè)定法56試劑酶的質(zhì)量要求7小結(jié)與展望目　錄酶法分析（enzymaticmethod）是以酶促反應(yīng)為基礎(chǔ)，酶作為主要試劑測(cè)定酶促反應(yīng)的底物、輔酶、輔基、激活劑或抑制劑，以及酶偶聯(lián)法測(cè)定酶活性等的一類(lèi)方法。代謝物酶法

2、分析技術(shù)是指用酶法分析的方法來(lái)測(cè)定人體內(nèi)的代謝物或代謝產(chǎn)物的技術(shù)。酶法分析酶活性單位1、慣用單位:由發(fā)明者自行命名，結(jié)果無(wú)可比性；（20世紀(jì)50年代）.2、國(guó)際單位:在特定條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（μmol/min）的酶量為一個(gè)“國(guó)際單位”：（76年）;63年是25℃及最適條件下.3、Katal單位：在規(guī)定條件下，即每秒鐘轉(zhuǎn)化1個(gè)摩爾底物（mol/s）的酶量.定時(shí)法：將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，用終止液終止反應(yīng)，通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)的方法測(cè)出底物或產(chǎn)物的總變化量，除以時(shí)間即可計(jì)算出底物消耗速度（－d[S]/min）或產(chǎn)物生成速度（d[P]/min），

3、將速度換算為μmol/min便是以國(guó)際單位表示的酶活性連續(xù)監(jiān)測(cè)法：將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，每隔一定時(shí)間（2s～60s）連續(xù)測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號(hào)的變化，從而計(jì)算出每分鐘的信號(hào)變化速率。連續(xù)監(jiān)測(cè)法是在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測(cè)定產(chǎn)物生成量或底物消耗量，選取線性期的速率來(lái)計(jì)算酶活性，又稱(chēng)速率法。臨床診斷MI的常用生化標(biāo)志物血中濃度動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)心肌標(biāo)志物分子量(kD)判斷值出現(xiàn)時(shí)間（h）達(dá)峰時(shí)間（h）恢復(fù)時(shí)間（h）升高倍數(shù)Mb17.8100μg/L0.5～25～1218～305～20CK86200U/L3～810～3672～965～25CK-MB86>25U/L,

4、3μg/L3～89～3048～725～20LD135>200U/L8～1824～726～10d3～5LD1135>40%總LDLD1/LD2>18～1824～726～10d5～10cTnT39.70.5μg/L3～610～245～10d30～200cTnI22.51.5～3.1μg/L3～614～207～14d20～50臨床常用的診斷急性心肌梗死常用標(biāo)志物一覽表肝臟疾病的三酶過(guò)篩試驗(yàn)（13000）ALT增高—肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷;（83%）GGT增高—膽汁淤積和對(duì)肝的誘導(dǎo)作用;（95%）ChE降低—肝臟的蛋白合成能力。是判斷肝臟疾病預(yù)后一個(gè)良好指標(biāo)。（74%）合計(jì)（99%）AST：71%、ALP

5、：60%、LDH：34%血清酶濃度在pg—ng水平，化學(xué)檢測(cè)濃度約mg—ug水平。酶測(cè)定方法1．絕對(duì)定量法：測(cè)定酶分子的絕對(duì)數(shù)量。2．相對(duì)定量法：測(cè)定酶分子的相對(duì)數(shù)量。（臨床生化介紹）相對(duì)定量法測(cè)定酶活性的依據(jù)：質(zhì)量作用定律。測(cè)定方法1、量氣法：操作繁瑣，靈敏度低，少用。2、比色法與分光光度法比色法：操作繁，技術(shù)要求高，靈敏度低，中止反應(yīng)。分光光度法：測(cè)定范圍廣，靈敏度較高，不需停止反應(yīng)不作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可倒入酶偶聯(lián)技術(shù)。3、熒光法和同位素法（放射性核素法）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可提高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，人工合成底物。不足：技術(shù)掌握較難，試劑儀器要求高，易產(chǎn)生非特異性熒光干擾測(cè)定。4、其它方法：離子選擇

6、電極法，旋光法、極譜法、高效液相色譜法。工具酶：作為試劑用于測(cè)定物質(zhì)濃度或酶濃度的酶酶學(xué)分析方法內(nèi)容：借助酶測(cè)定某化合物的濃度、借助酶測(cè)定另一種酶活力酶學(xué)分析類(lèi)型1．代謝物濃度的測(cè)定1）終點(diǎn)法2）動(dòng)力學(xué)法：零級(jí)反應(yīng)及一級(jí)反應(yīng)；2．血清酶測(cè)定動(dòng)力學(xué)法:零級(jí)反應(yīng)及一級(jí)反應(yīng)；特異性高，血清等體液樣品不需預(yù)處理就能測(cè)定，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序。試劑酶大多是蛋白質(zhì)，沒(méi)有毒性，避免了化學(xué)品對(duì)環(huán)境的污染。酶促反應(yīng)溫和，制成試劑盒可適用于自動(dòng)分析。代謝物酶法分析在準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度和線性測(cè)定范圍等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)的化學(xué)法。（血糖測(cè)定）酶法分析的主要優(yōu)點(diǎn)代謝物酶法分析平衡法?（終點(diǎn)法）速率法（動(dòng)力學(xué)法）第一節(jié)代謝

7、物酶法分析的原理平衡法是指標(biāo)本中待測(cè)物的量有限，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當(dāng)剩余的底物量很?。?1%～5%）時(shí)，指示反應(yīng)信號(hào)逐漸達(dá)到穩(wěn)定，即通常所說(shuō)的終點(diǎn)；所以又稱(chēng)為終點(diǎn)法(end-pointmethod)。平衡法的特點(diǎn)是測(cè)定底物的總變化量，即測(cè)定的是“濃度”。1、平衡法測(cè)定的理論基礎(chǔ)--終點(diǎn)法一、平衡法積分得：米氏方程改寫(xiě)為式中[S0]為待測(cè)物，[St]為待測(cè)物至反應(yīng)t時(shí)間后的濃度若反應(yīng)達(dá)到平衡，假設(shè)，即[S0]－[St