第05章-代謝物酶法分析技術(shù)

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1、第五章代謝物酶法分析技術(shù)2代謝物酶法分析技術(shù)是指用酶法分析的方法來測(cè)定人體內(nèi)的代謝物或代謝產(chǎn)物的技術(shù)。酶法分析（enzymaticmethod）是以酶為試劑測(cè)定酶促反應(yīng)的底物、輔酶、輔基、激活劑或抑制劑，以及利用酶促反應(yīng)測(cè)定酶活性的一類方法。代謝物酶法分析技術(shù)的概念3代謝物酶法分析平衡法（終點(diǎn)法）速率法（動(dòng)力學(xué)法）代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)14平衡法是指標(biāo)本中待測(cè)物的量有限，經(jīng)過酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當(dāng)剩余的底物量很?。?1%～5%）時(shí)，指示反應(yīng)信號(hào)逐漸達(dá)到平衡，即通常所說的終點(diǎn)，所以又稱為終點(diǎn)法(end-pointmethod)。平衡法的特點(diǎn)是測(cè)定底物的總變化量，即測(cè)定的是“濃度”。平衡法基

2、本理論(1)5速率法(rateassay)又稱動(dòng)力學(xué)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法，測(cè)定的是速率（通常指的是初速度），依據(jù)是當(dāng)?shù)孜锏南牧枯^小時(shí)(<5%)，酶促反應(yīng)呈一級(jí)反應(yīng)，此時(shí)的反應(yīng)速度（v）與代測(cè)物的濃度成正比例。速率法的關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成一級(jí)反應(yīng)。速率法基本理論(2)6在臨床操作中，只要測(cè)定期間待測(cè)物消耗<5%，只要測(cè)定兩個(gè)固定時(shí)間的吸光度差值，就可以采用標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)照法計(jì)算樣本濃度，這種方法又稱為固定時(shí)間法(fixedassay)。速率法基本理論(2)7平衡法的開始一段時(shí)間都有可能遵循一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。相反，速率法只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，也會(huì)達(dá)到平衡。對(duì)于平衡法來說關(guān)鍵是確定達(dá)到平衡所需的時(shí)間。對(duì)于速率法

3、來說關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成一級(jí)反應(yīng)。平衡法與速率法的相互聯(lián)系返回章目錄8酶作用的特異性高，血清等體液樣品不需預(yù)處理就能測(cè)定，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序；試劑酶大多是蛋白質(zhì)，沒有毒性，避免了化學(xué)品對(duì)環(huán)境的污染；酶促反應(yīng)溫和，制成試劑盒可適用于自動(dòng)分析。代謝物酶法分析主要優(yōu)點(diǎn)代謝物酶法分析在準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度和線性測(cè)定范圍等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)的化學(xué)法代謝物酶法分析的方法29待測(cè)物與產(chǎn)物在理化性質(zhì)上有便于檢測(cè)的信號(hào)，如吸收光譜不同則可直接測(cè)定待測(cè)物或產(chǎn)物本身信號(hào)的改變來進(jìn)行定量分析的方法稱為直接法。單酶反應(yīng)直接法(1)10單底物反應(yīng)直接測(cè)定法尿酸+O2+H2O尿囊素+CO2+H2O2膽綠素+H2O膽紅素+O

4、2尿酸在293nm處有吸收，而尿囊素沒有吸收，在293nm處測(cè)定吸光度下降膽紅素在450nm處有吸收，而膽綠素沒有吸收，在450nm處測(cè)定吸光度下降尿酸紫外法測(cè)定膽紅素測(cè)定11雙底物反應(yīng)直接測(cè)定法對(duì)于雙底物反應(yīng)，為了便于實(shí)驗(yàn)分析，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)一般將所加的另一種底物濃度設(shè)計(jì)得相當(dāng)大，即[S2]>>Km2，這時(shí)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可按單底物法處理，整個(gè)反應(yīng)只與待測(cè)物有關(guān)，呈一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。但在以NADH或NADPH為底物的終點(diǎn)法測(cè)定中，因340nm吸光度的限制，輔酶的用量不可能過高。12在340nm處測(cè)定吸光度的增加來進(jìn)行定量的方法乳酸測(cè)定雙底物反應(yīng)直接測(cè)定法乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙

5、酮酸測(cè)定在340nm處測(cè)定吸光度的下降來進(jìn)行定量的方法乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+13酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測(cè)的成分，將反應(yīng)某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個(gè)酶促反應(yīng)中，從而達(dá)到檢測(cè)目的的方法稱酶促偶聯(lián)法。最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個(gè)：一個(gè)是脫氫酶指示系統(tǒng)，另一個(gè)為過氧化物酶指示系統(tǒng)。酶偶聯(lián)法(2)14脫氫酶指示系統(tǒng)氧化型輔酶NAD(P)+在340nm處沒有吸收峰,還原型輔酶NAD(P)H在340nm處有吸收峰.15脫氫酶指示系統(tǒng)以脫氫酶為指示酶的系統(tǒng)測(cè)定的是氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)或氧化型輔酶Ⅱ(NADP+)變?yōu)檫€原型NAD(P)H后在340nm處的吸光度增高來計(jì)算出被測(cè)物的濃度，

6、也可利用脫氫酶的逆反應(yīng)，將還原型NAD(P)H變?yōu)檠趸蚇AD(P)+，測(cè)定340nm處吸光度的下降來計(jì)算被測(cè)物的濃度。16脫氫酶指示系統(tǒng)血清葡萄糖己糖激酶法測(cè)定Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反應(yīng)將NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH+H+，測(cè)定340nm吸光度上升的速度與葡萄糖的含量成正比17脫氫酶指示系統(tǒng)血清尿素測(cè)定尿素+H2O2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+測(cè)定340nm吸光度下降的速度與尿素的含量成正比，可以用速率法測(cè)定；也可以用平衡法測(cè)定18常用的試劑酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷

7、酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。體液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、膽汁酸、乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、唾液酸以及氨、鉀、鎂等離子的酶法測(cè)定大多使用該指示系統(tǒng)。脫氫酶指示系統(tǒng)19過氧化物酶指示系統(tǒng)共用的指示反應(yīng)最早由Trinder氏等人提出，被稱為Trinder反應(yīng)最大吸收峰為500nm，在可見光范圍內(nèi)比色。已廣泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、膽固醇、甘油三酯等項(xiàng)目的測(cè)定20過氧化物酶指示系統(tǒng)血清總膽固醇氧化酶測(cè)定法膽固醇酯+H2