酶法分析課件分解.ppt

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1、第12章酶法分析1.酶法分析的發(fā)展酶在定量分析中的應(yīng)用可以追溯到19世紀(jì)中期。當(dāng)時，曾采用麥芽提取物作為過氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測定過氧化氫。12.1概述早在1914年臨床上就開始采用脲酶測定尿中的尿素，但是在臨床實(shí)驗(yàn)室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當(dāng)時轉(zhuǎn)氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個有效手段。到了20世紀(jì)50年代前已有60種物質(zhì)能借助于酶法分析。近年來，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、食品、環(huán)境、生物及其它樣品的檢測。2.酶法分析的特點(diǎn)及應(yīng)用類型酶的特性酶法檢測的特點(diǎn)催化效率高專一性靈敏性強(qiáng)快速特異性、準(zhǔn)確不需要物理分

2、離，干擾少12.2酶法分析的方法及應(yīng)用示例一.酶活性的測定:1.初速率法2.固定時間分析法3.固定變化分析法4.偶聯(lián)法5.分光光度法及熒光法6.電化學(xué)法7.其它方法酶法分析中，被分析的對象可以是酶、底物、底物類似物、酶的活化劑或抑制劑等。1.初速率法一般采用過量的底物，使所有的酶的活性位點(diǎn)都被飽和。一般底物濃度為米氏常數(shù)的10倍以上，此情況下的酶的反應(yīng)速率視為初速率，是最大反應(yīng)速率的90%以上。（可用于米氏常數(shù)的測定）2.固定時間分析法（動力學(xué)研究方法）無連續(xù)檢測設(shè)備時，采用間隔一定時間，取出一定體積反應(yīng)液并終止酶作用進(jìn)行分析。要求：酶活性在催化過程中幾乎沒變

3、化；要采用使酶鈍化的措施：一般用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、三氯乙酸、過氯酸或SDS使酶失活，也可以用加熱的方法終止反應(yīng)。3.固定變化分析法把酶活性與要產(chǎn)生一定的變化量所需的時間關(guān)聯(lián)起來，即酶活性與產(chǎn)生一定的變化量成反比。例如pH的變化。4.偶聯(lián)法測定酶的活性舉例：葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP這個反應(yīng)中沒有明顯的光譜性質(zhì)的變化，無法對于酶活進(jìn)行測定。但是，葡萄糖-6-磷酸+ADP是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）的底物，并在NADP+（輔酶Ⅱ）存在下發(fā)生第二個酶反應(yīng)。葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+NADP+的最大紫外吸收在280nm

4、，而NADPH的紫外吸收在340nm，可以測定。己糖激酶將兩個酶偶聯(lián)起來以獲得可被檢測的信號G6PD要求：兩個酶催化反映的條件具有相容性；指示反應(yīng)在整個反應(yīng)中是非限速步驟，可以通過加大指示酶的用量來達(dá)到。分光光度法利用底物與反應(yīng)產(chǎn)物在紫外和可見光部分光吸收的不同，連續(xù)或測定反應(yīng)一定時間內(nèi)吸光度的變化。連續(xù)測定法適合于反應(yīng)速度較快的體系；而固定時間法適用于一些反應(yīng)速度較慢的體系。許多氧化還原酶都可以根據(jù)反應(yīng)過程中混合物吸光度的變化測定其活性。熒光法酶反應(yīng)的產(chǎn)物或底物之一有熒光或二者的熒光光譜不發(fā)生重疊就可以根據(jù)熒光的變化來測定酶的活性。由于酶分子中常有酪氨酸和色

5、氨酸，它們具有紫外吸收及熒光，在底物的選擇時要避開它們的干擾。電化學(xué)法電位計(jì)技術(shù)（如pH電極）對H濃度發(fā)生變化的酶促反應(yīng)，在實(shí)際測定時要加入酸或堿以維持溶液的pH不變，這樣才能使酶的活力不發(fā)生變化。而加入的酸或堿的速度就代表了酶促反應(yīng)的速度。極譜法（有氧電極法）有些酶促反應(yīng)中，由于氧氣的生成或消耗，引起溶液中溶解氧濃度的變化，從而引起電極之間電流大小的變化，由此可以計(jì)算出酶的活力，如葡萄糖氧化酶催化的反應(yīng)。比氣壓法靈敏，同時具有抗污染物干擾的特性其他方法量氣法：用于反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一是氣體的情況通過測量反應(yīng)過程中氣相的體積或壓力的變化便可以計(jì)算出氣體的釋放或吸

6、收的量。再根據(jù)氣體的變化和時間的關(guān)系就可以確定酶的活力。優(yōu)點(diǎn)：可以連續(xù)取得數(shù)據(jù)，以便了解整個酶促反應(yīng)過程。缺點(diǎn)：靈敏度和準(zhǔn)確度都較低其他方法量熱法：用非常靈敏的量熱計(jì)可以測定酶的反應(yīng)速度。該法靈敏，無干擾有些反應(yīng)的產(chǎn)物還可以與緩沖溶液發(fā)生二次反應(yīng)繼續(xù)放熱，從而增加測定酶活力的靈敏度。二.酶法分析的應(yīng)用類型酶活性的測定底物及底物類似物的測定活化劑和抑制劑的分析測定12.2.1酶活性的測定概述幾種酶活力的測定方法概述酶的提取純化酶活力的表示方法測定酶活力的四個操作步驟酶活力的概念酶活力：就是酶催化反應(yīng)的能力。用酶促反應(yīng)初速度(reactionvelocity或re

7、actionrate)來表示，即酶催化反應(yīng)速度愈快，酶的活力就愈高，速度愈慢，酶的活力就愈低。活力單位(U)與比活力　　其中一個稱酶活力國際單位，規(guī)定為：在特定條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物，或者底物中1微摩爾有關(guān)基團(tuán)所需的酶量，稱為一個國際單位（IU，又稱U）。另外一個國際酶學(xué)會議規(guī)定的酶活力單位是Kat，規(guī)定為：在最適條件下，1秒鐘能使1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量。Kat和U的換算關(guān)系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat如何測定酶活力？以產(chǎn)物濃度對反應(yīng)時間作圖，可得到酶促反應(yīng)速度曲線0時間注意：初速度的測定是關(guān)鍵，為什么？二.酶活力及其測定1.酶

8、活力概念可見，反應(yīng)速度只在最初一段時間