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《酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)四酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)免疫標(biāo)記技術(shù)定義：將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測(cè)定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測(cè)定法：HRP，AP免疫酶測(cè)定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn)：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：可
2、溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.原理（1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接（或建立關(guān)聯(lián)）。（2）通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。它將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專一性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，可對(duì)生物體內(nèi)各種微量有機(jī)物的含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。3.分類直接法（directELISA）：將已知抗原直接吸附于載體，加酶標(biāo)抗體檢測(cè)抗體間接法（In
3、directELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，加酶標(biāo)記二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測(cè)液相中的可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體（1）?直接法測(cè)定抗原A.將抗原吸附在載體表面；B.加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；C.加底物。底物的降解量＝抗原量。（2）間接法測(cè)定抗體A.將抗原吸附于固相載體表面；B.加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測(cè)定底物的降解量＝抗體量。（3）
4、雙抗體夾心法測(cè)定抗原A.將抗體吸附于固相表面;B.加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原A.將抗體吸附在固相載體表面;B.加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體；對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)4.原理（以間接ELISA為例）：顯色間接法測(cè)定豬瘟抗體——定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)材料豬瘟病毒（CSFV）——抗原樣品——待測(cè)豬血清HRP標(biāo)記豬抗兔IgG——二抗包被緩沖液：0.025
5、MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：TMB，底物緩沖液，30%H2O2酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀間接法測(cè)定豬瘟抗體——定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法1.抗原的處理：2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔的抗原稀釋液4℃，濕盒內(nèi)，18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次3.加待測(cè)血清標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽(yáng)性待測(cè)4.加二抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，
6、3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法1、取已包被豬瘟病毒抗原的酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），用樣品稀釋液（PBS）將待檢樣品1∶40稀釋后加入板孔中，每孔加100μl。同樣1∶40稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)1孔，每孔100μl。另設(shè)一空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加100μl稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫育30分鐘。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200
7、μl/孔，每次在干凈吸水紙上拍干。3、每孔加酶標(biāo)二抗（抗豬IgG-HRP結(jié)合物）100μl，置37℃溫育30分鐘。4、洗板：洗滌3次（方法同步驟2）。5、顯色與終止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混勻。室溫避光顯色，10分鐘后，每孔加終止液（0.25%氫氟酸）1滴(50μl)，終止反應(yīng)。6、15分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。采用波長(zhǎng)630nm的酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。檢測(cè)樣本的OD值≥0.35為陽(yáng)性。具體操作步驟預(yù)期結(jié)果陽(yáng)性：顯色為黃色（藍(lán)色）陰性：無(wú)色1234陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性注意事項(xiàng)洗滌徹底，避免交叉污染。按順序加樣，孔底無(wú)氣泡。包被和溫育在濕盒內(nèi)進(jìn)行。
