酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)——ELISA.ppt

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1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆誆LISA的基本原理掌握ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg的原理、操作方法及結(jié)果判斷熟悉表面抗原檢測(cè)的臨床意義（一）ELISA的原理ELISA的基本原理三種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）②酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）③酶作用的底物在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。

2、加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。（二）方法類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法1雙抗體夾心法——是檢測(cè)抗原最常用的方法操作步驟1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，此時(shí)固

3、相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。應(yīng)用此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。2間接法——是檢測(cè)抗體常用的方法基本步驟1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，

4、從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色。應(yīng)用檢測(cè)Ab的最常用的方法只要更換不同的固相Ag，可以用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與Ag相應(yīng)的Ab。3競(jìng)爭(zhēng)法其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。方法相同ELISA的基本步驟包被—洗滌—封閉—洗滌—加樣—加酶結(jié)合物—加底物、顯色劑—終止液—酶標(biāo)儀檢測(cè)包被將抗原或抗體固定化的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳

5、酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。固相載體固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。固相載體微顆粒帶有蛋白質(zhì)結(jié)合功能基團(tuán)，結(jié)合容量大、反應(yīng)速度快膜載體硝酸纖維素膜

6、（NC）、玻璃纖維素膜、尼龍膜，非共價(jià)鍵結(jié)合，但吸附能力強(qiáng)斑點(diǎn)ELISA洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。封閉●包被好的固相載體表面常留有少量未吸附位點(diǎn)，可非特異地吸附

7、測(cè)定時(shí)加入的標(biāo)本和酶標(biāo)記物中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致本底偏高。因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～20％小牛血清等包被一次，消除上述干擾，此過程稱為封閉?！褚话阏f來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。　　加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。加酶結(jié)合物結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高