狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆與表達分析.pdf

《狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆與表達分析.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆與表達分析劉洪偉2012屆碩士中國林業(yè)科學研究院萬方數(shù)據(jù)分類號Q781密級公開UDC學位論文狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆與表達分析CloningandAnalysisofACasbeneSynthaseGenefromEuphorbiafischerianaSteud.劉洪偉指導教師姓名邱德有研究員申請學位級別碩士專業(yè)名稱生物化學與分子生物學研究方向林木分子育種論文提交日期2012年5月論文答辯日期2012年6月學位授予日期2012年7月答辯委員會主席評閱人北京·中國林業(yè)科學研究院萬方數(shù)據(jù)學位論文狼毒大戟蓖麻烯合酶基因的克隆與表達分析學位論文

2、作者劉洪偉指導教師姓名邱德有研究員申請學位級別碩士專業(yè)名稱生物化學與分子生物學研究方向林木分子育種論文答辯日期2012年6月中國·北京萬方數(shù)據(jù)DissertationfortheDegreeCloningandAnalysisofACasbeneSynthaseGenefromEuphorbiafischerianaSteud.Candidate:LiuHong-WeiSupervisor:QiuDe-YouAcademicDegreeAppliedfor:MasterBiochemistryandMolecularSpeciality:BiologyDateofDef

3、ence:2012.6Degree-Conferring-Institution:ChineseAcademyofForestry萬方數(shù)據(jù)獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得本研究生培養(yǎng)單位或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：日期：年月日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解中國林業(yè)科學研究院有關(guān)保留、使用學位

4、論文的規(guī)定，中國林業(yè)科學研究院有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)中國林業(yè)科學研究院可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。（保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書）學位論文作者簽名：導師簽名：年月日年月日學位論文作者畢業(yè)聯(lián)系方式工作單位：聯(lián)系電話：電子郵件：通訊地址、郵編：萬方數(shù)據(jù)摘要大戟科植物含單萜、倍半萜、二萜及三萜，這些化合物很多都具有毒性或者潛在的治療活性。佛波酯類化合物Prostratin是一種巴豆烷(tigliane)型二萜。上世紀90年代美國國

5、立癌癥研究所從大戟科植物Mamala樹(HomalanthusnutansGuill.)中分離到Prostratin并被證實其具有良好的抗艾滋病病毒作用，所以近年來巴豆烷型二萜化合物生物合成途徑的研究引起了廣泛的關(guān)注。蓖麻烯合酶(casbenesynthase)被認為是合成巴豆烷型二萜的關(guān)鍵酶，人們推測通過該酶催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)環(huán)化成中間體西松烷(cembrane)，接著由西松烷變成蓖麻烯(casbene)，再通過一系列電子轉(zhuǎn)移形成巴豆烷。我國科學家也從大戟科狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud.)中分離到Prostratin

6、。本研究以狼毒大戟根為材料，通過RACE-PCR克隆蓖麻烯合酶，對其及另外幾個物種的13個蓖麻烯合酶進行了生物信息學分析；構(gòu)建原核表達載體，并在大腸桿菌中進行了表達；純化融合蛋白，進行酶促反應，并通過氣質(zhì)聯(lián)用檢測反應產(chǎn)物。本論文為今后通過代謝工程技術(shù)提高Prostratin提供了一定的可能。主要研究結(jié)果如下：1.采用RACE-PCR技術(shù)從狼毒大戟根中克隆到一個蓖麻烯合酶基因，命名為EfCS(GenBank登錄號:JN862821)。該基因長1969bp，編碼602個氨基酸，具有典型的萜類合酶的基因結(jié)構(gòu)。2.通過生物信息學方法，利用GenBank上登錄14個蓖麻烯合酶基因

7、序列，分析預測了其核酸及氨基酸序列、組成成分、導肽、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、疏水性/親水性、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及功能域等。結(jié)果表明，14個CS基因?qū)牡鞍壮仕嵝?。含量最高的氨基酸均為Leu。核苷酸同源性比對結(jié)果顯示，CS基因主要被分成了兩大類，且與導肽預測數(shù)據(jù)對應。研究還發(fā)現(xiàn)這些CS不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，肽鏈呈親水性。二級結(jié)構(gòu)中主要結(jié)構(gòu)元件為α-螺旋，包含兩個萜類合成酶功能域。3.成功將蓖麻烯合酶基因亞克隆到原核表達載體pET32a中，得到含有目的基因的pET32a-EfCS原核表達重組質(zhì)粒。I萬方數(shù)據(jù)4.將重組質(zhì)粒pET32a-