葡萄查耳酮合酶基因克隆及表達分析

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2、－．‘ｉＶ一？？．．．＇．．．也＇．＇．■．■？ｙ，－／二／．？．－．４、Ｊ學位論文獨創(chuàng)性聲明本人承諾：所呈交的學位論文是本人在導師指導下所取得的研巧成果。論文中除特別加Ｗ標法和致謝的地方外不包含他人和其他機構(gòu)已經(jīng)撰寫或發(fā)表過的研巧成果其他同志的研究成果對本人的啟示和所提供的幫助均已在論文中做了明確的聲明并表示謝Ｊ３、〇學位論文作者簽名：幕建早學位論文版權(quán)的使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解江寧師范大學有關(guān)保留、使用學位論文的

3、規(guī)定及學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部口或機構(gòu)送交復印件或磁盤允許論文被查闊和借閱。本文授權(quán)迂寧論全進、學用影師范大學可將位文的部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫并行檢索可采印制、匯論文且子文容和紙論的內(nèi)容縮印或掃描等復手段保存編學位并本人電檔的內(nèi)質(zhì)文一。相致。保密的學密位論文在解后使用本授權(quán)書達吏侵論簽：秦導簽：學位文作者名指教師名Ｈ平＇■■簽：日名日期必年月＾／遼寧師范大學碩士學位論文摘要類黃酮物質(zhì)的合成途徑中的關(guān)鍵酶為查耳酮合酶(chalconesynthase，CHS)，它催化3分子的丙二酰輔酶A

4、(malonylCoA)與1分子的香豆酰CoA(coumarylCoA)生成4，5，7-三羥基黃烷酮(narigeninchalcone)。葡萄果實中含有極其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中包括多酚類物質(zhì)，是一種大眾性水果，常用于鮮食、制成果汁、葡萄干和葡萄酒等。但葡萄的抗逆性較差，易受環(huán)境影響，導致其產(chǎn)量和質(zhì)量下降。為探討CHS基因在葡萄植株防御體系中的作用，以及在次生代謝物合成中的作用，本實驗進行如下研究：1.實驗中，以NCBI和TIGR數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用RT-PCR技術(shù)，從葡萄中成功克隆得到兩個查耳酮合酶（CHS）的cDNA開放閱讀框（

5、ORF）序列VvCHS1和VvCHS3。其中，VvCHS1序列長1182bp，編碼393個氨基酸；VvCHS3序列長1170bp，編碼389個氨基酸。2.在TIGR基因索引數(shù)據(jù)庫中，以Grape和chalconesynthase為關(guān)鍵詞進行搜索，查詢出具有同源性的VvCHS基因的所有EST序列。利用NCBI的ORFFinder程序，對得到的序列進行ORF預(yù)測，結(jié)果顯示具有完整ORF的序列共5個，并利用軟件對其進行生物信息學分析。分析內(nèi)容包括：各種氨基酸的組成（種類及數(shù)量），以及蛋白的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)（信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域等）、疏水

6、性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，啟動子中含有的順式作用元件和進化分析等。3.葡萄葉片經(jīng)過紫外線（UV）輻射和水楊酸（SA）噴灑處理后，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對VvCHS1和VvCHS3的表達量的變化情況進行分析。通過實驗和數(shù)據(jù)分析處理，得出結(jié)論：在不同的處理條件下，二者的相對表達量均出現(xiàn)了具有一定的規(guī)律性的變化，結(jié)果顯示為先上升后緩慢下降趨勢，且都在12h處表達量達到最高值。這表明VvCHS1和VvCHS3基因通過調(diào)節(jié)表達量參與植物抗逆過程。本文對葡萄查耳酮合酶VvCHS1和VvCHS3基因克隆，以及對其所編碼蛋白的理化性質(zhì)和進化關(guān)

7、系分析，為進一步研究該基因的功能及其在葡萄適應(yīng)性機制中的調(diào)節(jié)作用以及代謝轉(zhuǎn)換奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：葡萄遺傳；查耳酮合酶；基因克隆；生物信息學分析；實時熒光定量PCRI葡萄CHS基因的克隆及表達分析CloningandexpressionanalysisofchalconesynthasefromVitisviniferaAbstractChalconesynthaseisakeyenzymemetabolicpathwaysfrombenzenepropanemetabolismtoflavonoidssynthesis.Itsca

8、talytic3malonylCoAwith2moleculescoumaticacylCoAgenerated4，5，7-thihydroxyflavanone(narigeninchalcone).Thegrapescontainsextrem