青稞查爾酮合酶基因的克隆與原核表達

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1、，■？—？，分類號Ｓ５口．３０７３學(xué)號Ｓ２０１２１１０３西川巧化大學(xué)顧壬學(xué)位論文青裸查爾剛合酶基因的克隆與原核表達方建抱専教師巧宗５教授學(xué)科專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向植物分子生物學(xué)２０１５年５月ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎａｎｄＰｒｏｋａｒｏｔｉｃＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｙｐＣｈａｌｃｏｎｅＳｎｔｈａｓｅＧｅｎｅｈｉｉｎｅＨｕ

2、ｌｌｅｓｓ巧ａｒｌｅｙＱｇｋ（ｙ）ＢｙＪｉａｎＦａｎｇＡｄｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＺｏｎｇｙｕｎＦｅｎｇＭａｊｏｒ：ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＤｉｒｅｃｔｉｏｎ：ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｙ，２０１５論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行研究工作所?。崳姷玫某晒?。盡我所知，除了文中特別加Ｗ標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含

3、為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料一。與我同王作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。■口５研究生簽名：表又／年月＇ｙ曰關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部口或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版允許論文被查閱和借閱，，可Ｗ采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可Ｗ用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。□本論文不保密。

4、□本論文保密。，在＿年解密后適用本授權(quán)＂＂（請在Ｗ上□內(nèi)劃Ｖ）一＾／娘１＞蘭研究生簽名；乃戶年。居月日導(dǎo)師簽名：可＾月／ＪＴ日＾臺摘要青裸（材ｏＷｅｗ／ｗＶＭ如ｗｅＬ．ｖａｒ．Ｈｏｏｋ．巧是我國青藏高原地區(qū)對多棱裸粒大麥＂＂的統(tǒng)稱，即裸大麥。青裸不僅屬于Ｈ高兩低（高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪和低糖－Ｂ）食品，更含有豐富的功能活性成分如黃爾類化合物、Ｙ氨基下酸、多酷類化合物、－葡聚糖等這些營養(yǎng)物質(zhì)對人的身體具有保健作用族維生素Ｗ及Ｐ，。隨著人民生活水平的提高，青裸的營養(yǎng)價

5、值亦受到更加重視。一黃麗是植物中、清除自由基、類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、提高免疫力防止骨質(zhì)疏松、保護肝臟等藥理作用，是人們的理想保健物質(zhì)。黃爾在植物中主要有黃麗、黃爾醇、黃搞麗、異黃廁等十幾類青裸中主要Ｗ黃廁醇為主。查爾爾合酶（Ｃ試Ｓ）為黃麗，一個關(guān)鍵限速酶代謝途徑的第，廣泛分布在植物界，并且在植物的生長和適應(yīng)環(huán)境活動中一起著重要作用。，近年來也成為分子生物學(xué)及植物生理學(xué)的研究熱點之＂＂－９４－為了了解黃麗代謝途徑中相關(guān)酶基因的作用本實驗Ｗ青裸１９１為材料巧用同，源克隆的方式，克隆出

6、了青裸查爾麗合酶基因的編碼序列（Ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＤＳ）全長，－３２ａ－并構(gòu)建載體ｐＥＴ／／ｖＣ／玲進行原核表達得到了其融合蛋白。本實驗主要結(jié)果如下；１．采用同源克隆的方法獲得了青裸Ｃ端的ＣＤＳ全長序列，全長為１３５１ｂｐ，該序列包一含個完整的開放閒讀框（〇ＲＦ）ｎ９７ｂｐ，該ＯＲＦ編碼３％個氨基酸。序列分析表明：４３４ＫＤａ５說該基因編碼蛋白分子量．等電點為預(yù)測等電點（ＰＩ偽是酸性蛋白巧酶蛋白，，的不穩(wěn)定系數(shù)（巧為４０．１０（大于４０），屬于不穩(wěn)定蛋白，預(yù)測其半衰期為３０

7、ｈ，平均親水指－０數(shù)為．０９０是親水性蛋白。，２．Ｂｉａｓ也對比分析結(jié)果表明：該全長序列與大麥同源性最高，達到９９％，與普通小麥同源性為９１％；與水稻同源性為８８％。與玉米同源性為８５％；與高梁同源性為７８％；５％－７４％之間與荀萄、矮牽牛、橄攬、馬鈴著、西紅柿等已知的Ｃ占Ｓ基因的同源性在６。進一步構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示青棵與單子葉植物的大麥、普通小麥的親緣關(guān)系最近相對雙，子葉植物如西紅柿等關(guān)系較遠。３．使用在線服務(wù)器ＰＨＹＲＥ２Ｓｅｒｖｅｒ結(jié)合ＳＯＰＭＡ軟件對ＨｖＣＨＳ酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)－

8、４１％、％－進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)ＨｖＣＨＳ酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由ａ螺旋（無規(guī)則卷曲（１２、及））ＰＩ５％組成－Ｎ－卻具豐轉(zhuǎn)角０）。進行蛋白質(zhì)的Ｎ糖基化和憐酸化預(yù)測，沒有發(fā)現(xiàn)糖基化位點，富的磯酸化位點聲個絲氨酸（Ｓｅｒ）、６個蘇氨酸（Ｔｈｒ）和２個酪氨酸（Ｔｙｒ）存在磯酸化活性位點。４－．將青棵Ｃ／擬基因的編碼序列與表達