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1、包涵體純化方案緩沖液配方：1.變性復性緩沖液緩沖液A：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA①,100mMNaCl②,1%TritonX-100③緩沖液B：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，1%TritonX-100，2M脲素④緩沖液C：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，1%TritonX-100緩沖液D：50mMTris-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，1%TritonX-100，2M鹽酸胍④溶解緩沖液E：50mMTri
2、s-HCl(pH8.5),1mMEDTA,100mMNaCl，10mMβ-巰基乙醇/DTT⑤，2mM脫氧膽酸鈉⑥，8M脲素復性緩沖液：50mMTris-HCl(pH8.5)，100mMNaCl，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸⑦，5%甘油⑧，0.2%PEG⑨，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM還原型谷胱甘肽⑩2.純化緩沖液Bindingbuffer：50mMTris-HCl,100mMNaCl,10mM咪唑，pH8.5Elutionbuffer：50mMTris-HCl,100mMNaCl,不同濃度梯度咪唑,pH8.5具體實施步驟：1.大量誘導表達的菌
3、液7000rpm離心10min。棄上清，用1×PBS重懸，洗滌菌體細胞，7000rpm，離心10min。再用PBS重復洗一遍。離心后留菌體沉淀。2.將菌體細胞用緩沖液A重懸，液氮中反復凍融后，超聲破碎。13000rpm離心10min，棄上清，收集包涵體沉淀。2.分別用緩沖液B、C、D超聲清洗包涵體沉淀。13000rpm離心10min收集沉淀。3.用緩沖液E溶解包涵體，緩慢搖動使其緩慢溶解，室溫放置30min，然后13000rpm離心10min。取上清。4.將上清稀釋至0.1-1.0mg/ml，裝入透析袋中，放置于梯度復性緩沖液中，4℃緩慢透析24
4、-36h。最后在純化bindingbuffer中透析，確保蛋白穩(wěn)定可溶。5.對溶解的包涵體蛋白進行親和層析。附注：①EDTA防止蛋白降解②NaCl一定的鹽離子可降低某些帶電基團間的斥力③TritonX-100除去其他細菌成分，如膜外蛋白，質粒DNA和其他雜質④脲素，鹽酸胍，洗掉包涵體表面的不溶性雜蛋白⑤β-巰基乙醇/DTT作為還原劑打開錯配的二硫鍵⑥脫氧膽酸鈉作為離子型去垢劑能促溶蛋白⑦⑧甘氨酸、甘油促溶⑨PEG可逆修飾折疊中間體的疏水基團⑩氧化型和還原型谷胱甘肽促進二硫鍵的形成。(11)1g菌使用35ml液體重懸即可。
