資源描述：
《共附生微生物抗腫瘤活性菌的篩選、鑒定及活性產(chǎn)物的研究.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、共附生微生物抗腫瘤活性茵的篩選、鑒定及活性產(chǎn)物的研究摘要癌癥是當(dāng)今危害人類健康的主要疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命。目前醫(yī)學(xué)臨床上常用的大多數(shù)藥物只能使病情緩解，無法達(dá)到完全治愈的目的，所以抗腫瘤新藥的開發(fā)一直是藥物研究領(lǐng)域的主要方面。微生物在自然界物質(zhì)循環(huán)過程中維持著生物圈的動態(tài)平衡，很多微生物和動植物保持著共生或附生的關(guān)系。動植物體內(nèi)的共附生微生物因其所處宿主環(huán)境的不同而顯示出較為獨特的代謝途徑與生理活性。共附生微生物被認(rèn)為是天然活性產(chǎn)物的重要來源。本實驗以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為篩選模型對分離自海綿和植物組織的一些共附生微生物進行抗腫瘤活性菌株的篩選。分別采
2、用了MTT法、SRB法、染料排斥法這三種細(xì)胞毒篩選方法對252株微生物菌株的發(fā)酵提取物進行了抗腫瘤活性的篩選，比較了三種方法的篩選結(jié)果，選取了7株具有良好抗腫瘤活性的菌株。重點對一株植物內(nèi)生真菌YX．5進行了鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、活性產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究，還通過硅膠柱層析，反相柱層析等分離方法對其活性產(chǎn)物進行了分離，通過GC．MS、NMR等手段對主要的活性成分進行了鑒定。通過本論文的研究為環(huán)境微生物資源以及抗腫瘤活性物質(zhì)的開發(fā)提供了一定的實踐基礎(chǔ)。論文主要研究結(jié)果如下：(1)SRB法、MTT法、染料排斥法三種方法篩選表明，252株菌株中有大約28％的測試菌株在提取物濃
3、度為100肛g／mL時對HeLa細(xì)胞的抑制率在50％以上，且活性菌株基本一致，具有較好的相關(guān)性。經(jīng)復(fù)篩后確定有6株細(xì)菌和1株真菌具有良好且穩(wěn)定的抗腫瘤活性，其提取物在100pg／mL時對HeLa細(xì)胞的抑制率均在80％以上，其中活性最高的YX．5對HeLa細(xì)胞的IC50達(dá)到了5．33肛g／mL。(2)經(jīng)場發(fā)射掃描電鏡觀察、菌落形態(tài)觀察以及ITSrDNA序列分析，初步鑒定真菌YX-5為米曲霉(Aspergillusoryzae)。(3)通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基、pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間以及搖床轉(zhuǎn)速等條件，以菌體干重，代謝物產(chǎn)量以及抗腫瘤活性為指標(biāo)，確定YX．5的最佳發(fā)酵條
4、件為GPY培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵溫度25。C、發(fā)酵時間7d、適宜pH為7．0、搖床轉(zhuǎn)速110r／min。(4)以高溫、pH、紫外線和蛋白酶處理下代謝產(chǎn)物的抗腫瘤細(xì)胞活性為指標(biāo)，對YX-5活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進行了研究。結(jié)果顯示，菌株YX．5的代謝產(chǎn)物對紫外線和蛋白酶處理有較高的抗性，在超過100℃或在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性有較大幅度的下降，不過仍然具有一定的抗腫瘤活性，總體來講YX．5的活性物質(zhì)穩(wěn)定性較高。(5)YX-5經(jīng)規(guī)?；l(fā)酵(25L)、發(fā)酵液乙酸乙酯萃取后，得到粗提物5．15g，將粗提物按極性高低初步分為三部分：正己烷相、二氯甲烷相和65％甲醇水相，經(jīng)SRB法測定，活性
5、組分主要集中在二氯甲烷相。采用薄層層析法選擇分離YX-5活性產(chǎn)物的溶劑體系和溶劑比例，結(jié)果表明，二氯甲烷和甲醇體系適用于YX．5活性產(chǎn)物的分離。在初次的硅膠層析柱時，以甲醇含量分別為2％、10％、20％、100％的氯仿．甲醇洗脫體系進行梯度洗脫，結(jié)果顯示活性組分主要集中在10％甲醇洗脫段。經(jīng)兩次ODS反相柱層析后對柱分離產(chǎn)物進行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)10．15號餾分具有抗腫瘤細(xì)胞活性。合并10．15號餾分，通過GC．MS及混合氫譜核磁共振大致確定主要的活性物質(zhì)為一些曲霉酸和環(huán)二肽類物質(zhì)。關(guān)鍵詞：共附生微生物；抗腫瘤活性；篩選鑒定；發(fā)酵條件；活性物質(zhì)JlIHMIIIMII
6、IHJScree血gandIdentifica鋤。ftheAnti—燃孑IromSymbioticMicrobialIsolatesandActiveCompoundsThereofABSTRACTCancerisoneofthemostlife-threateningdiseasesintheworldnow,andcurrentpharmaceuticalsusedintreatingcancercanonlyreliefsymptom，butcouldnotcompletelycurethecancer．Thusdevelopmentofantitumor
7、drugsisalwaysahotaspectinmedicineresearches．Microorganismshavearoleinkeepingadynamicequilibriuminnaturemasscirculationprocess，amongthemvariesofmicroorganismshavekeptasymbioticlepiphyticrelationshipwithplantsoranimals．Dependonthedifferenceofthehosts’invivoenvironment,thosesymbioticmic
8、robesusually
