甘草酸誘導(dǎo)HO-1表達(dá)調(diào)控對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)的研究.pdf

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyofPoptosisEffecteaboutGlycyrrhizicacidtoRegulableHO-·1ExpressiononSMMC7721CellsByShiYingyingSupervisor：Prof．ShanJieBiochemistryandMolecularBiologyBasicMedicalSchoolJune2012原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)

2、注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者：日期：年月日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)

3、位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者：日期：年月日．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．_．．．．．一中文摘要甘草酸誘導(dǎo)Ho．1表達(dá)調(diào)控對(duì)SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)的研究碩士生時(shí)英英導(dǎo)師單杰鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室河南鄭州450052‘研究背景：肝癌是一種常見的惡性腫瘤，而血紅素加氧酶(HO．1)是腫瘤細(xì)胞中一類保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的酶，可被眾多因素誘導(dǎo)表達(dá)升高，轉(zhuǎn)錄因子BTB．CNC同源異構(gòu)體1(bachl)屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠負(fù)性調(diào)節(jié)HO

4、．1的表達(dá)，降低肝癌細(xì)胞中HO．1的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)作用。鑒于HO．1在腫瘤治療中所起的保護(hù)作用，我們?cè)噲D建立一種系統(tǒng)來提高Bachl的表達(dá)從而達(dá)到抑制HO．1的表達(dá)的目的，Tct-on基因表達(dá)系統(tǒng)是一種可控的高效表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒兩部分，控制調(diào)節(jié)質(zhì)粒的是四環(huán)素(Te)及其衍生物doxycylin。然后通過甘草酸干預(yù)細(xì)胞，檢驗(yàn)當(dāng)腫瘤細(xì)胞中HO．1表達(dá)降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。目的：構(gòu)建鹽酸多西環(huán)素表達(dá)調(diào)控的真核表達(dá)載體pBI．EGFP。bachl，并檢測(cè)bachl和HO．1的表達(dá)；MTT檢測(cè)肝癌細(xì)胞對(duì)甘草酸的藥物敏感性及藥物作用下HO

5、．1的表達(dá)情況；DNALadder與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)抑制HO．1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。方法：1．將質(zhì)粒pQE30．bachl用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將質(zhì)粒PBI．EGFP及PCR法擴(kuò)增的Bachl用NhcI和MluI進(jìn)行雙酶切，回收大約2170bp大小片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒PBI—EGFP．bachl，雙酶切鑒定；2．利用脂質(zhì)體法將Tot．On質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pBI．EGFP．Bachl雙轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC．7721細(xì)胞，48h后RT-PCR法檢測(cè)Bachl以及HO．1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，確定鹽酸多西環(huán)素的濃度；3．RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞SMMC．7721加入甘草酸4

6、8h后HO．1的表達(dá)；4．用MTT法檢測(cè)肝癌細(xì)胞SMMC．7721對(duì)甘草酸的藥物敏感性，計(jì)算IC503中文摘要5．DNALadder檢測(cè)抑制HO．1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；6．通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase．3的表達(dá)情況。結(jié)果：Nhel和MluI雙酶切重組質(zhì)粒pBI—EGFP．Bachl，凝膠電泳及PCR產(chǎn)物測(cè)序顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；Tet-on與重組質(zhì)粒pBI—EGFP．Bachl雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)顯示雙轉(zhuǎn)染組bachl表達(dá)顯著升高，同時(shí)相應(yīng)的抑制了HO．1的表達(dá)；設(shè)置不同濃度的鹽酸多西環(huán)素，確定最佳誘導(dǎo)濃度為3

7、000ng／ml；MTT檢測(cè)甘草酸的IC50為3．27i-0．037mmol／L，RT-PCR檢測(cè)甘草酸藥物組HO．1的表達(dá)隨甘草酸濃度的增高而受到抑制；與正常空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Tet-on與重組質(zhì)粒pBI-EGFP．Bachl+1．5mmol／L甘草酸組及轉(zhuǎn)染Tebon與重組質(zhì)粒pBI-EGFP—Bachl組出現(xiàn)明顯的DNAladder，而1．5mmol／L甘草酸組DNAladder不明顯；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)升高。小結(jié)：1．本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了真核表達(dá)載體pBI．EGFP．Bachl，并證實(shí)其能在人肝癌SMMC77

8、21細(xì)胞中的大量表達(dá)ba