酵母菌選育、最適培養(yǎng)基篩選及菌種發(fā)酵培養(yǎng).doc

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1、酵母菌選育、最適培養(yǎng)基篩選及菌種發(fā)酵培養(yǎng)河北師范大學生命科學學院08級生物技術專業(yè)［摘要］在無菌條件下，用紫外線對酵母菌(yeast)進行不同時長的照射誘變處理，選出合適的誘變菌種進行振蕩培養(yǎng)。經振蕩培養(yǎng)后的誘變菌種運用正交試驗設計的方法采用四個因素三個水平選出最適的菌種培養(yǎng)基，進行進一步的發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵罐中加入最適培養(yǎng)基成分和合適的酵母菌誘變菌種進行發(fā)酵擴培，最終獲得大量的菌種和發(fā)酵產物。［關鍵詞］酵母菌，紫外線，最適培養(yǎng)基，正交試驗設計，發(fā)酵培養(yǎng)面包酵母(Saccharomycescerevisiae)是一種單細胞微生物，是酵母菌的一種，它含蛋白質50%左

2、右，氨基酸含量高，富含B族維生素，還冇豐富的酶系和多種經濟價值很高的生理活性物質。幾千年前人類就用面包酵母發(fā)酵面包和酒類,在現(xiàn)代食品工業(yè)方面，廣泛用作人類主食面包、饅頭、包子、餅干糕點等食品的優(yōu)良發(fā)酵劑和營養(yǎng)劑。本實驗選用的物理誘變因子為紫外線，DNA能強烈吸收紫外線，尤其是堿基中的胸腺嚨噪，從而在形成二聚體，改變DNA結構，引起基因突變。本實驗的面包酵母菌經不同時長的紫外線誘變處理，培養(yǎng)出的適合的誘變菌種進行最適的菌種培養(yǎng)基的篩選和發(fā)酵培養(yǎng)。最適菌種培養(yǎng)基的篩選是通過正交實驗設計進行的。正交試驗設計(Orthogonalexperimentaldesign)是

3、研究多因素多水平的乂一種設計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分冇代表性的點進行試驗，這些冇代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，正交試驗設計是分式析因設計的主要方法，是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法。正交表是一整套規(guī)則的設計表格，用L為正交表的代號，n為試驗的次數(shù)，t為水平數(shù)，c為列數(shù)，也就是可能安排最多的因素個數(shù)，本實驗采用了四因素三水平進行最適培養(yǎng)基的篩選。選出合適的誘變菌種和適合誘變的酵母菌生長的培養(yǎng)基后，便可以能過發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，分時段觀察記錄發(fā)酵過程中的PH,溶氧，菌種數(shù)。繪制出面包酵母的生長曲線1材料與方法1.1實驗材料菌種

4、：面包酵母菌儀器：高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，光學顯微鏡，恒溫培養(yǎng)搖床，分析天平，小型發(fā)酵罐用品：槍頭及1訊和0.5mL移液器，三角瓶，試管，玻璃涂棒，平皿，血球計數(shù)板，酒精燈，棉河北師范大學生命科學學院08級生物技術專業(yè)塞，試管架，蓋玻片，記號筆試劑：酵母膏，蛋白月東，（NH4JSO4,葡萄糖PDA培養(yǎng)基，PDA液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）：去皮馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、自來水1000毫升、自然PH［其做法是稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個小時，紗布過濾，再加10~20g葡萄糖和17~20g瓊脂，，高壓蒸氣（121°C）滅菌

5、20分鐘,冷卻后貯存?zhèn)溆?。?.2試驗方法1.2.1酵母菌選育1）制備PDA固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（不加瓊脂），將所用用具如玻璃涂棒，9mL無菌水試管，培養(yǎng)皿，斜面試管等包好，121°C,30min高壓蒸汽滅菌。2）在超凈工作臺中，制備固體培養(yǎng)基平板和液體培養(yǎng)基試管，用移液器取lmL菌懸液加入9mL無菌水試管，依次進行濃度梯度稀釋，取稀釋菌液進行計數(shù)，選取合適濃度梯度，進行涂板。3）由于固體培養(yǎng)基制備的量不足，實驗選取2個濃度梯度，紫外線照射時長選定為50s,70s,90s,進行涂布，涂布平板情況如下（表1）,涂布后，紫外燈下照射誘變。表1涂布平板個數(shù)濃度梯度O

6、s50s70s90s1x10712221x10812224）誘變后在30°C培養(yǎng)2天后，進行平板計數(shù)，計算死亡率，挑取誘變單菌落于PDA液體培養(yǎng)基中30°C振蕩培養(yǎng)。1.2.2最適培養(yǎng)基篩選1）酵母菌發(fā)酵配方：酵母膏10g,蛋白月東10g,（NH4）2SO45g,葡萄糖20g,PH6.4,選取酵母膏，蛋白腺，（NH4）2SO4,葡萄糖四個因素配成培養(yǎng)基母液，按四因素三水平的正交表（表4）和實驗因素與水平表（表2）配制液體培養(yǎng)基，后進行高壓蒸汽滅菌。表2實驗因素與水平水平因素123酵母膏0.5%1%2%蛋白腺0.5%1%2%（NH4）2SO40.25%0.5%1

7、%葡萄糖1%2%4%2）將酵母菌菌液加于液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)2天，用活體計數(shù)法計算試管內菌體密河北師范大學生命科學學院08級生物技術專業(yè)度，進行級差分析。1.2.3菌種發(fā)酵培養(yǎng)1）按照設備流程圖認識發(fā)酵罐，了解發(fā)酵培養(yǎng)的流程。2）校正pH計（4?6.68）根據(jù)正交試驗設計結果配制最適培養(yǎng)基，將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基12L（酵母膏180g＞蛋白月東60g、（NH4）2SO460g＞葡萄糖240g）倒入發(fā)酵罐中，進行分批滅菌（開啟401,關閉404與302開啟攪拌，開啟202關小403使溫度上去至118°C10分鐘滅菌之后，開啟401關小402開啟203與A9將

8、接種蓋開松。關閉405與