資源描述：
《酵母雙雜交酵母單雜交酵母三雜交課件.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、酵母雙雜交是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與反式轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)上是組件式的，即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain，簡(jiǎn)稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，簡(jiǎn)稱為
2、AD)。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。 最常用的是酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞作為報(bào)道株 具有許多優(yōu)點(diǎn):〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇
3、的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因?！?〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的BD-Baitprotein融合蛋白。將編碼AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上,在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白。如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)相互作用，從而激活lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。所以我們可以通過轉(zhuǎn)化的酵母的表型來(lái)確定誘餌
4、蛋白和靶蛋白是否有相互作用。這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成ADE、HIS、LEU、TRP，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因ADE、HIS、LACZ、MEL1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái)，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。綜上：酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合
5、及對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫(kù)質(zhì)粒。3、將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。4、酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會(huì)相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報(bào)告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能當(dāng)我
6、們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體
7、之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 ??? 酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶N
8、S3，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的?；蚪M中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基
