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1、WesternBlot技術(shù)專輯之PAGE膠電泳和轉(zhuǎn)膜PAGE倒膠的儀器我們?cè)谇懊鎃esternBlot儀器之選已經(jīng)介紹過(guò)了，除了順手的工具能防止漏膠，PAGE配膠的試劑和配方比例對(duì)電泳結(jié)果的質(zhì)量當(dāng)然有決定性的影響，這個(gè)配膠的比例，在《分子克隆》上有詳細(xì)的論述，相信大家都不難查到。容易忽視的問(wèn)題主要在于過(guò)硫酸銨（AP）一定要新鮮——最好用小指管配AP（寫日期）保存在-20度，超過(guò)2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多次的AP都別用，小氣病發(fā)作的后果往往是得不償失——膠凝不好多半是這里疏忽（或者混合不勻），因?yàn)橄鄬?duì)配膠的其他組分
2、，AP算最活躍分子——如果還有諸如漏加某組分或者配比錯(cuò)誤或者Buffer搞錯(cuò)，那絕對(duì)是你自己找罵，不值得同情。水要用去離子的純水，MilliQ級(jí)更好。Cambrex(原來(lái)的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很貴，也很好——配出的膠對(duì)200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE膠，條帶清晰漂亮，可惜一直沒有搞清楚配方的奧秘；但是數(shù)十倍于丙烯酰胺粉劑的價(jià)格令人卻步，不過(guò)，對(duì)接觸丙烯酰胺粉塵嚴(yán)重過(guò)敏的人可以選擇這個(gè)。更加豪華的選擇是已經(jīng)凝好的預(yù)制膠，各種配方各種比例各種梳孔大小多少任君選擇，打開即用，當(dāng)然更直接方便，更吸引人的是結(jié)果漂亮
3、，分辨率高，特別是重復(fù)性好，條帶真正是"razorsharp"??！平時(shí)都能用這么豪華的東西心情當(dāng)然超爽啊，實(shí)驗(yàn)緊湊又輕松，效率也更高??！如果實(shí)驗(yàn)都能這么“好馬配好鞍”，想必更容易出結(jié)果，也就更容易拿經(jīng)費(fèi)吧！什么時(shí)候我們的實(shí)驗(yàn)才能實(shí)現(xiàn)這種良性循環(huán)?。nvitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原來(lái)的FMC）PAGEr都是首選預(yù)制膠?？墒窃凇吧鐣?huì)主義初級(jí)階段”這種奢侈品平時(shí)流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的優(yōu)惠活動(dòng)，買3盒NuPAGE預(yù)制膠就送電泳儀或者電轉(zhuǎn)移，面對(duì)這種誘惑，你難道就沒有一點(diǎn)非份之
4、想的沖動(dòng)？上樣電泳：上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過(guò)多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè)條帶都彎彎地“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說(shuō)明控制電流，不要過(guò)多重復(fù)使用電泳Buffer（別小氣，重復(fù)使用會(huì)降低緩沖能力的），好像基本不會(huì)出問(wèn)題了。當(dāng)預(yù)染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)最佳分辨區(qū)——分離膠的2/3處，OK，電泳結(jié)束了。電泳結(jié)果檢查：如果要做WesternBlot，是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然最好。考馬斯亮藍(lán)使用簡(jiǎn)便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色
5、方法。銀染操作復(fù)雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白?？墒怯捎诳捡R斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過(guò)固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的WesternBlot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步——同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說(shuō)明問(wèn)題。如果想在轉(zhuǎn)膜前看看電泳結(jié)果，你需要用SYPROTangerine——這種金色熒光蛋白染料靈敏度很高——檢測(cè)4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用非常簡(jiǎn)單，最重要的是由于不用酸堿或者有機(jī)溶劑固定，不干擾蛋白活性，特別適合Western轉(zhuǎn)膜前的染色，或者非變性膠的活性蛋白的檢測(cè)（比如染色后還需要在膠上
6、進(jìn)行活性檢測(cè)等等）?？上YPROTangerine價(jià)格挺貴的，500ul（5000x）要2000元，即使很節(jié)約的用只夠大概100多次呢。所以最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗春紅的檢測(cè)靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過(guò)PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過(guò)“轉(zhuǎn)膜”步驟——從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行WesternBlot的檢測(cè)和顯色，而且為了防止沒有電場(chǎng)的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。在轉(zhuǎn)移膜上顯色其實(shí)就像是畫家
7、在畫布上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當(dāng)之重要。WesternBlotting亦是如此，沒有選擇好合適的轉(zhuǎn)移膜是無(wú)法做出漂亮的結(jié)果的。因此，選擇適合的轉(zhuǎn)移膜，要讓轉(zhuǎn)移“膜”高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的實(shí)驗(yàn)。WesternBlot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（NitrocelluloseBlottingMembranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。具體哪種膜適合于哪些實(shí)驗(yàn)?zāi)?？選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的
8、結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。籦.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜，就像國(guó)畫要選擇
