Western blot 轉膜及膜的選擇.pdf

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1、Westernblot轉膜及膜的選擇轉膜：經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質樣品需要經(jīng)過“轉膜”步驟——從PAGE膠轉移到膜上固定，才能用各種方法進行WesternBlot的檢測和顯色，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴散，轉移要盡快進行轉膜的首要是選膜。在轉移膜上顯色其實就像是畫家在畫布上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當之重要。WesternBlotting亦是如此，沒有選擇好合適的轉移膜是無法做出漂亮的結果的。因此，選擇適合的轉移膜，要讓轉移“膜”高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的實驗。WesternBlot印跡常用的轉移膜主要是硝酸纖維素膜（Nitrocel

2、luloseBlottingMembranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。具體哪種膜適合于哪些實驗呢？選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。籦.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉移膜，就像國畫要選擇宣紙，油畫要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。轉膜是對westernblot最終結果影響最大的一步，轉膜質量的好

3、壞直接決定了實驗結果的好壞。轉膜的影響因素不多，主要有膜的選擇、轉印方法和實驗操作三個方面。首先是膜的選擇問題。膜的選擇主要從實驗目的和實驗要求來考慮。例如，要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經(jīng)受住嚴酷的清洗條件。常用的westernblot用膜有NC膜、PVDF膜和尼龍膜，它們的一些主要的特點總結如下表：NC膜尼龍膜PVDF膜靈敏度和分辨高高高率背景低較高低125－200ug/cm2（適合于S

4、DS結合能力80－110ug/cm2>400ug/cm2存在下與蛋白質的結合）材料質地干的NC膜易脆軟而結實機械強度高溶劑耐受性無無有操作程序緩沖液潤濕,避免氣泡緩沖液潤濕使用前100%甲醇潤濕常規(guī)染色，比較于NC膜，可常規(guī)染色，可用放射性和非不能用陰離子檢測方式用考馬斯亮藍染色，可用于ECL放射性檢測染料檢測，快速免疫檢測。0.45um一般蛋白低濃度小分子0.2um一分子量小于20kD蛋白、酸性蛋適用范圍蛋白白、糖蛋白和蛋糖蛋白檢測和蛋白質測序0.1um一分子量小于7kD蛋白多糖(主要用白在核酸檢測中)價格價格較便宜便宜較貴其次是轉膜方法的選擇。主要有半干法轉膜和濕法轉膜。半干法操作要求

5、高，但效率也高。濕法操作要求相對低，花時間多一些。最后是實驗操作方面的問題。使用PVDF膜的時候需要進行預處理，這里面會帶來一些問題，如甲醇潤濕不夠，膜的有些區(qū)域不能很好的結合蛋白就會引入誤差。膜上面一定不要有油脂類的東西，否則也會影響蛋白結合和抗體的雜交。1.硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉移介質，對蛋白有很強的結合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要

6、特別嚴謹?shù)那逑礂l件。轉移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，Schleicher&Schull公司的一個實驗表明，轉移到NC膜上的幾種蛋白4度條件下保存5年依然保持免疫識別特性，依然可以得到清晰可信的WesternBlot結果。不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復清洗的用途——因為經(jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話最好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜——混有含醋酸纖維（CM）的NC膜結合力

7、會有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果最好）。硝纖膜最為大家熟悉和認可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL，另外羅氏、Invitrogen、GE（Amersham）、SantaCruz等公司都有提供各式的硝纖膜（估計OEM的可能性比較大，不過有時挺奇怪的，OEM