生物實驗：酪蛋白磷酸肽制備.ppt

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1、實驗十四酪蛋白磷酸肽制備設計性實驗一．原理活性肽大都以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)長鏈中,如果用適當?shù)拿杆?可得到活性多肽。酪蛋白磷酸肽（簡稱CPPs)，就是以牛乳酪蛋白為原料,經(jīng)單一酶或復合酶水解分離而得到的一種含有成簇磷酸絲氨?；亩嚯摹Ｔ摱嚯牡纳砘钚耘c分子中的氨基酸組成和排列順序有關,同時又取決于CPPs制備工藝中所使用的酶，研究表明選用胰蛋白酶單酶法水解，CPPs具有較高的生物活性。酪蛋白磷酸肽的生物活性表現(xiàn)為，在pH呈中性至微堿性的動物小腸下端,能與Ca+2、Fe+2和Zn+2等金屬離子結(jié)合,阻止這些金屬離子與磷

2、酸根結(jié)合產(chǎn)生沉淀,使小腸內(nèi)可溶性的鈣、鐵和鋅的濃度增加,從而促進這些必需金屬離子的吸收和利用。多肽研究現(xiàn)狀具有生物活性的多肽，特別是短肽的發(fā)現(xiàn)和研究，已經(jīng)成為多肽類藥物和功能性食品添加劑開發(fā)和研究的熱點與焦點。活性肽大多以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)長鏈中，如果用適當?shù)拿杆猓鼈兊幕钚跃捅会尫懦鰜?。近年來已?jīng)有很多具有生物活性的多肽通過蛋白質(zhì)的消化被發(fā)現(xiàn)并分離出來。牛奶是大眾食品，更是一種其它食品無法取代的營養(yǎng)品，牛乳中的酪蛋白，過去一直認為它僅僅只是營養(yǎng)蛋白，為生物提供氨基酸和氮源，很少注意到它是否可以經(jīng)蛋白水解釋放出活性

3、肽，但目前眾多的研究表明，通過不同的蛋白酶水解酪蛋白可以獲得豐富的生物活性肽。這些活性肽中研究最多的是酪蛋白磷酸肽關于胰酶和胰蛋白酶分別代表兩種不同酶（單酶和復酶），酶源廣泛易得，價格也相對比較便宜。胰酶和胰蛋白酶提取自動物胰臟。胰酶是由胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等構(gòu)成的混合酶系，來源豐富，價格低廉。其中它的重要成分胰蛋白酶和糜蛋白酶（占90%以上）起水解作用。胰蛋白酶主要通過胰酶的分離純化得到，價格比胰酶要高，但它的專一性強，切割酪蛋白后產(chǎn)生的富含磷酸絲氨酸的短肽長度適中，既富集了磷酸絲氨酸基團，同時又使該肽

4、段易于分離。其它蛋白酶則由于切割位點不適合而難以得到富含磷酸絲氨酸的肽。此外，胰蛋白酶的最適PH在中性稍偏堿性區(qū)域，而在此PH范圍內(nèi)，酪蛋白的溶解度也比較大，有利于反應進行。在采用胰蛋白酶水解酪蛋白時，水解PH應控制在8.5。CPP的評價指標由于CPP的功能性質(zhì)（促進鈣的吸收和利用）要通過體外模擬或活體動物實驗才能給予評定，因此不適合作為評定指標。分子結(jié)構(gòu)決定其功能性質(zhì)，但多肽的測定非常復雜，因此CPP的分子結(jié)構(gòu)也不可能作為評定的指標。酪蛋白分子中含有磷酸基的數(shù)目是一定的,N/P越小，則產(chǎn)品中不含磷酸基的肽段被切除和分離

5、得越多，CPP的肽鏈就越短、產(chǎn)品的純度也就越高。因此N/P值能較客觀地反映CPP肽鏈的長短及磷酸基的密度，可作為CPP的特性指標。功能:其功能表現(xiàn)出抗齲齒、抗骨丟失、增強受精和胚胎發(fā)育等。是21世紀重點開發(fā)的藥物和功能食品。酪蛋白——堿性蛋白酶水解體系是制備生物活性多肽——酪蛋白磷酸肽的有效酶解體系。美、日已將其作為補鈣功能食品的原料，德國也將其列入藥典。1.促進鈣的吸收Ca在腸道中必須以離子的形式才能被吸收，在小腸前段維生素D作為Ca吸收促進劑可加強Ca在小腸前段的主動吸收。而在小腸后段Ca的吸收形式是被動擴散，吸收效

6、率取決于小腸內(nèi)Ca離子的游離濃度。Ca在小腸后段中性至弱堿性環(huán)境中易與磷酸根離子結(jié)合形成不溶性鹽而降低游離Ca離子的濃度使吸收率降低，CPPs在中性或弱堿性條件下其核心部位磷酸絲氨酸集中了大量的負電荷，能與鈣、鐵、鋅等元素的二價離子螯合形成可溶性鹽，提高礦物元素的溶解性，螯合物被腸壁細胞吸收后釋放出礦物元素，從而提高了礦物元素的吸收和利用率，同時還可以有效地延長礦物質(zhì)在體內(nèi)的滯留時間。CPPs抑制磷酸鈣沉淀的機理的解釋磷酸鈣沉淀在剛形成時是無定形的狀態(tài)，然后逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榫w并長大，CPPs能黏附在無定形物的表面，抑制其進一

7、步的成長，腸內(nèi)的鈣以很高的頻率和CPPs不斷接觸、釋放，保持游離狀態(tài)，在不受磷酸根的作用狀態(tài)下被帶到腸粘膜。CPPs與鈣具有適度的結(jié)合，這樣的結(jié)合強度使得CPPs分子中一個磷酸絲氨酰基可以保護30多個鈣離子不被沉淀，并足以推動大量的溶解鈣向腸黏膜轉(zhuǎn)運，而又不至于因結(jié)合太緊密而影響鈣的吸收。依賴磷酸絲氨酸簇在小腸內(nèi)與其他二價離子（鐵、鋅、錳、銅、硒等）形成可溶性絡合物，依靠被動擴散增加這些元素被機體吸收的數(shù)量。2.防止齲齒酪蛋白磷酸肽-磷酸鈣溶液能憑借高鈣濃度梯度促進牙釉質(zhì)早期齲齒的再礦化，防止口腔細菌產(chǎn)生的酸對牙釉質(zhì)的脫

8、礦質(zhì)作用，具有抗齲齒功能。具體原理為：CPPs磷酸絲氨酸簇結(jié)合鈣后，以非晶體形式定位在牙蝕部位，磷酸絲氨酸鈣鹽提供自由的Ca離子和磷酸根形成的緩沖液，減少了釉質(zhì)的脫礦，從而有效防止牙蝕細菌的侵蝕和造成脫礦過程。用CPPs制成的抗齲齒添加劑是目前唯一不同于氟化物的添加劑，因此，許多口腔護理產(chǎn)品已經(jīng)應用CPPs。3.提高