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《胰島素在小鼠受精卵早期發(fā)育中的作用》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、中國科學C輯:生命科學2008年第38卷第10期:956~962《中國科學》雜志社www.scichina.comlife.scichina.comSCIENCEINCHINAPRESS胰島素在小鼠受精卵早期發(fā)育中的作用于秉治,張哲,鄧欣,徐小燕,馮晨,李延笑,崔城,宿文輝,趙鴻梅,于大海中國醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室,沈陽110001E-mail:ybzbiochem@yeah.net收稿日期:2008-04-15;接受日期:2008-06-06國家自然科學基金(批準號:30570945)資助項目摘要大量研究已經證實生長因子和激素在胚胎早期發(fā)育的細胞增殖與分化過程中起
2、著重關鍵詞要的作用.應用定量ELISA,RT-PCR,免疫印跡和免疫熒光的方法檢測胰島素在小鼠受精卵小鼠和卵母細胞中的表達和定位.發(fā)現胰島素均勻分布在卵細胞的胞漿中.同時也檢測到mTOR胚胎(mammaliantargetofrapamycin)和p70S6K的表達、活性和定位.在小鼠受精卵中mTOR和胰島素mTORp70S6K的表達沒有明顯不同.二者在G1,G2和M期分布在細胞漿,在S期聚集在原核的周S6K圍.在不同時期,mTOR的活性是波動的.利用PI3K的特異性抑制劑渥曼青霉素,觀察到卵裂率明顯減低.當使用mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素時,受精卵的第一次有絲分裂延遲.這些
3、結果表明胰島素存在于小鼠的卵母細胞和受精卵中,并且胰島素可能通過激活PI3K/PKB/mTOR/S6K的信號傳導通路在小鼠的早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮功能作用.胰島素是一種由胰腺的β細胞合成與分泌,在糖有檢測到胰島素.在研究小鼠的受精卵的早期發(fā)育代謝調節(jié)和新陳代謝的途徑中發(fā)揮重要調控作用的中,本實驗組發(fā)現了一些胰島素的下游效應因子,如[1]激素.胰島素通過與受體結合而發(fā)揮作用,已經證mTOR和S6K,在小鼠的受精卵中表達,具有活性,實胰島素可能在哺乳動物的早期發(fā)育階段中對新陳并發(fā)揮著重要的作用.既然PI3K/PKB/mTOR/S6K[2]代謝、細胞增殖、分化發(fā)揮重要的作用,包括母源途徑
4、需要胰島素信號的刺激才能被激活,那么受精的(如insulin)和胚胎源的(如IGF-Ⅱ)因子都可能調卵當中是否存在PI3K/PKB/mTOR/S6K的上游信號節(jié)其早期階段的發(fā)育[3].有研究[4~6]顯示PI3K-分子——胰島素,我們認為有必要對胰島素及其受體PKB-mTOR與胰島素下游信號傳導通路相關.mTOR在小鼠卵母細胞和受精卵中是否表達進行檢測.[7]是一個磷脂酰肌醇激酶-相關激酶家族的成員并且1材料和方法在細胞生長中起關鍵作用.胰島素可以激活mTOR,1.1小鼠胚胎的收集和培養(yǎng)激活的mTOR通過它的下游效應因子核糖體40S亞單位蛋白S6激酶1(S6K1)和eIF起始因
5、子4E結合4~6周齡成熟雌性昆明系小鼠(由中國醫(yī)科大學蛋白1(4EBP1)調節(jié)蛋白質合成.mTOR通路的完全實驗動物部提供),經嚴格明暗循環(huán)喂養(yǎng)4天后,腹腔活化需要來自營養(yǎng)(如氨基酸與葡萄糖)和生長因子注射孕馬血清促性腺激素10IU(PMSG,天津市華孚(如胰島素)的雙重作用,并能促進細胞生長和抑制凋高新生物技術公司),46~48h后腹腔注射絨毛膜促性亡.腺激素10IU(hCG,上海生物化學制藥廠),將注射[3]hCG的雌鼠分別與分開飼養(yǎng)的8周齡以上成熟雄性早期研究曾報道在小鼠的1-細胞期胚胎中沒956中國科學C輯:生命科學2008年第38卷第10期昆明系小鼠合籠過夜,次日清晨
6、檢查雌鼠陰栓,有陰底片經凝膠成像分析系統進行掃描成像.栓者為交配成功,注射hCG后16~19h脫頸椎處死雌1.4mTOR激酶活性測定鼠,取雙側輸卵管,實體鏡下于M2培養(yǎng)液(購自mTOR在小鼠1-細胞胚胎中激酶的活性用文Sigma公司)中撕開壺腹膨大處,使受精卵自然流出,獻[10~12]中的方法檢測.50個小鼠的1-細胞胚胎用透明質酸酶除顆粒細胞,移入M16培養(yǎng)液(購自裂解緩沖液(20mmol/LTris-HCl,pH7.5,含1%Sigma公司)中,于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)相應時NP-40,1mmol/LEGTA,1mmol/LEDTA)4℃裂解.間后,收集G1,S,G2
7、以及M期受精卵.激酶的活性用4-EBP1作底物分析,在一個反應混合1.2RT-PCR液中包括(20mmol/LTris-HCl(pH7.5),75mmol/LNaCl,10mmol/LMgCl2,1mmol/LDTT,20μmol/L將收集到的各期受精卵(每期300個),以Quick-32ATP,5μCi[γ-P]ATP)20μL的體積中分析,反應進PrepMicromRNAPurification試劑盒(購自Amersham行30min,在30℃條件下,取25μL反應液點于Bioscien