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《全長cdna文庫及構(gòu)建方法與應(yīng)用進展》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、重慶醫(yī)學(xué)2011年6月第4O卷第16期1639·綜述·全長cDNA文庫及構(gòu)建方法與應(yīng)用進展韓慧霞綜述，陸洪光，王魯審校(1．貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，貴州貴陽550004；2重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科關(guān)鍵詞：DNA，互補；基因組文庫；實驗室技術(shù)和方法doi：10．3969／j．issn．1671-8348．2011．16．034文獻標(biāo)識碼：A文章編號：16718348(2011)161639—04互補DNA(complementaryDNA，cDNA)文庫是指生物不的文庫在建庫效率、全長比例和代表性等方面都有所提高，；。同生長發(fā)育時期，特定組織或器官所轉(zhuǎn)錄的全部m
2、RNA經(jīng)反2004年Clepet等用TDNA連接酶替代TRNA連接酶，轉(zhuǎn)錄形成的eDNA與載體連接后形成的克隆的集合，cDNA文在一定程度上提高了寡核苷酸mRNA的連接效率，提高了文庫是在基因組水平上研究某一生物特定器官、組織和發(fā)育時期庫全長比例。同年Ota等用此法完成了21243條日本人基因表達的前提和基礎(chǔ)。全長cDNA文庫是生物體內(nèi)完整cDNA文庫的構(gòu)建和測序，所構(gòu)建文庫中大約有85的克隆的mRNA分子反轉(zhuǎn)錄而獲得的DNA分子群集，是mRNA分為全長。Kim等改良此法，提出RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA子群的一個完整的拷貝。全長cDNA文庫不僅提供完整的末端快速
3、擴增(RNAligase—mediatedrapidamplificationofcDmRNA信息，而且可以通過基因序列比對得到mRNA剪接信NAends，RLM～RACE)。2006年Sunderland等[。用RIM—息，此外，還可以對蛋白質(zhì)序列進行預(yù)測及進行體外表達和通RACE確定擬南芥LIG1基因所有可能的轉(zhuǎn)錄起始位點。過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等。全長cDNA文庫的優(yōu)點2009年Tsuchihara等一將Oligo—capping法與大規(guī)模平行測明顯，克隆大部分是全長的，有效提高了基因測序和生物信息序技術(shù)結(jié)合，提出以高通量方式收集轉(zhuǎn)錄起始位點(tran
4、scrip—學(xué)分析的進程，利于后期蛋白質(zhì)表達及功能分析。目前幾乎所tionstartsites，TSS)信息和定量分析轉(zhuǎn)錄物表達水平的方法。有構(gòu)建全長eDNA文庫的方法都是基于真核生物完整mRNA改良后的Oligocapping法被廣泛用于實驗研究。SumioSuga—的一個共同特征一一“帽子”結(jié)構(gòu)，即mRNA的5端存在的no實驗室利用此法不斷完善人類基因轉(zhuǎn)錄起始位點數(shù)據(jù)庫和mGpppNp結(jié)構(gòu)。多數(shù)eDNA文庫構(gòu)建過程大致為分離總?cè)LcDNA文庫，通過對選定人類和小鼠cDNA5端的測序，RNA，純化tuRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后與兩端帶有限制性獲得3．3億新
5、標(biāo)簽E1]。酶切位點的人工接頭相連接，并將其插入到載體中，轉(zhuǎn)染大腸2SMART法桿菌，得到cDNA文庫。近年來全球眾多學(xué)者一直在有計劃、RN『A反轉(zhuǎn)錄5末端交換機制(switchingmechanismat5大規(guī)模地進行一些重要模式生物的全長cDNA文庫的構(gòu)建及endofRNAtranscript，sMART)是在第一鏈合成時使用專利研究，如擬南芥、水稻、果蠅、小鼠及豬等]，這些生物全長SMARTIV寡核苷酸產(chǎn)生大量全長雙鏈cDNA。此法是在cDNA文庫已構(gòu)建完成，得到大量有重要價值的數(shù)據(jù)。本文主PCR基礎(chǔ)上利用sMARTscr
6、heMMIV反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)要介
7、紹幾種比較常用的全長cDNA文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用移酶活性及限制性內(nèi)切酶SfiI的特性，快速構(gòu)建全長cDNA進展。文庫。sMARTscr．he”MMIVRT是由小鼠白血病病毒1Oligocapping法(moloneymurineleukemiavirus，MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶點突變而該法最早由Maruyama和Sugano于1994年建立。它利獲得，無RNaseH活性。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄到達tuRNA的5端時，RT用完整的mRNA分子具有5端帽子結(jié)構(gòu)，而部分降解的mR能在相應(yīng)的核酸3端添加一段oligo(dC)，對于非全長cDNA，NA分子沒有此結(jié)構(gòu)的特點，采用寡核苷酸(
8、o1ig0nucle0tide)替由于反轉(zhuǎn)錄沒有延伸到mRNA的5端，RT不能在其不完整換mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，并標(biāo)記mRNA的5端。的3端加上oligo(dC)。合成cDNA第二鏈時，對于截短的第首先利用細(xì)菌堿性磷酸酶(bacterialalkalinephosphatase，一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄酶沒有識別到mRNA的5端帽子結(jié)構(gòu)，3BAP)水解5端無mGpppNp一保護的部分，降解5磷酸基團，端攜帶的oligo(dG)第二鏈引物就不能與截短的第一鏈cDNA并防止截短的mRNA在后續(xù)反應(yīng)中與寡核苷酸連接；然后用片段結(jié)合，最終得到的是全長雙鏈cDNA。在實驗流程中
9、，煙草酸焦磷酸酶(tob
