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1、全長cDNA主要構(gòu)建方法的比較摘要全長cDNA文庫的構(gòu)建是進行功能基因組研究的一種經(jīng)濟、快速、有效的途徑，克服了傳統(tǒng)cDNA文庫的缺點，本文主要介紹了兩種較為實用的方法，分別是SMART法和Captrapper法。關(guān)鍵詞：全長cDNA構(gòu)建SMART法Captrapper法隨著測序技術(shù)和計算機科學的不斷發(fā)展，大部分生物和人類的基因組全序列測定高速完成。cDNA作為基因克隆的一種重要工具，在幫助人們更好的發(fā)現(xiàn)新基閃和研究基閃功能上發(fā)揮了巨大的作用。但是，由于傳統(tǒng)的cDNA由于反轉(zhuǎn)錄能力差，cDNA酶切位點保護不徹
2、底和非cDNA片段插入導致克隆片段短、無效克隆多和全長率低等缺點，因而無法滿足人規(guī)模、高通量、高效的功能基因組研究需要。而全長cDNA序列大多數(shù)擁有5'和3’端非編碼區(qū)序列，因而彌補了傳統(tǒng)cDNA文庫構(gòu)建方法的缺陷，成為目前基因克隆的一種重要方法。目前主要有CAPture法，Oligocapping法，SMART法，Capjumping法以及Captrapper法。本文主要介紹優(yōu)點突出的兩個方法，SMART法和Captrapper法。SMART方法SMART方法是Chenchik等1996年提出的［3］,該方
3、法利用PowerscriptTMRT反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄、末端轉(zhuǎn)移活性和內(nèi)切酶sfil的特性，快速、簡單地構(gòu)建企長cDNA文庫。PowerscriptTMRT反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLVR點突變而來的，喪失了RnaseH的活性，但保留著野生型聚合酶轉(zhuǎn)移酶的活性，能夠長距離的反轉(zhuǎn)錄，乂可識別mR-NA5’帽子結(jié)構(gòu)。原始一鏈合成中，轉(zhuǎn)移酶的活性低，延伸效率低。用于反轉(zhuǎn)錄的5’端poly（A）引物和延伸模板分別含有sfil（A）、sfil（B）識別位點的寡聚核苷酸序列。而截短的一鏈cDNA,反轉(zhuǎn)錄酶沒有識別到mRNA5’帽子結(jié)
4、構(gòu)，一鏈CDNA3/端不能被延伸、合成和擴增二鏈。兩端含有sfil識別位點的全長cDNA,經(jīng)兩種類型（A、B）內(nèi)切酶sfil酶切，使兩端產(chǎn)生不同的粘性末端，而全長cDNA內(nèi)部由于sfil識別位點在基因組屮很少見而得以保護，這樣就實現(xiàn)了目的全長基因的高效定向克隆。與其他方法相比，此方法有其獨特的優(yōu)點（1）所需起始材料少，一般O.5~lugmRNA（2）mRNA在合成cDNA前無耑任何酶反應或化學反應處理，不會導致處理過程中mRNA的降解和損耗。（3）實驗過程快速、簡單，整個過程沒有對mRNA和屮間產(chǎn)物的復雜處理
5、。（4）全長比例較高［13］。SMART方法也有其自身明顯的缺點（：1）PCR擴增具有選擇性，不利于長片段序列的擴增，使一些長片段的全長基因丟失，不易得到大于3kb片段和低峰度全長基因［13］2）dG加尾效率低，導致文庫中基因信息丟失，文庫缺乏代表性。在實際應川屮，該方法快速、簡單的優(yōu)點使之廣受青睞［14?17］，尤其是在醫(yī)學領(lǐng)域屮應用較廣［18?20】。4CAP-trapper方法CAP-Trapper方法是由Carninci等提出的［4］,它是根據(jù)mRNA5,端及3’端存在一個共同二醇結(jié)構(gòu)來建庫。將這種二
6、醇結(jié)構(gòu)氧化后進行生物素修飾，再經(jīng)過沉淀、酒精洗滌、無RNase的雙蒸水重新懸浮等篩選步驟，得到生物素化的mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cD-NA第一鏈，接著進行RNasel處理，未被cDNA保護的mRNA被降解。后經(jīng)青鏈霉素磁珠吸附并使用弱堿降解mRNA,得到單鏈全長cDNA,在末端轉(zhuǎn)移酶的催化下進行5’端01igo(G)加尾，再進行第二鏈的合成，定向克隆即可得到全長cDNA文庫。為了提高合成全長cDNA的能力和測序效果，該方法進行了改進。一是用海藻糖、山梨糖醇熱啟動反轉(zhuǎn)錄反應。mRNA5’端二級結(jié)構(gòu)阻礙反轉(zhuǎn)錄
7、的進行，高溫破壞二級結(jié)構(gòu)但同時也抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性。海藻糖的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保證反轉(zhuǎn)錄酶的活性在55?60°C的高溫下正常發(fā)揮，有利于全長cDNA的合成。二是用Ssth或Bsal、BamHlXhol雙酶切替換EcolTXhol雙酶切。EcolT對甲基化不敏感，容易將全長cDNA近端的閃部已甲基化的識別位點切割。用對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Ssth或BsaT、Bamlll等替換Ecoll,提高了文庫全長比例。三是用SSLM法加尾克服Oligo(G)加尾對測序的干擾［25］,雖然加尾效率(44%)
8、稍抵于Oligo(G)加尾(52%),但該法加尾對片段無選擇性，且加尾時無須使川MnC12和CoC12，不會造成全長cDNA降解，還利于全長cDNA的轉(zhuǎn)錄和表達克?。?6'271。與其他方法相比，CAP-Trapper方法可以說是一種較好的構(gòu)建髙質(zhì)S:全長文庫方法，它兼顧了文庫代表性好，全長比例高，建庫效率高的優(yōu)點［13,28］。但也有些缺點(：l)mRNA長期暴露在酶反應體系中，有降解風險(；2)
