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1、擬南芥全長cDNA探究進展【摘要】全長cDNAs是基因組序列注釋和基因及其產物功能分析的基礎。目前共分離了155,144個RIKEN擬南芥全長（RAF）cDNA克隆。將得到的155,144個RAFLcDNAs進行了3'端表達序列標簽聚類成14,668個非冗余cDNA類，其中60%預測到基因。同時已從14,034個非冗余cDNA類中獲得了5'ESTs,并構建成啟動子文庫。RAFLcDNAs序列數據庫的建立有助于啟動子分析、預測出轉錄本單元的正確注釋和基因產物的注釋。而且，全長cDNAs還為表達譜分析、功能分析和植物蛋白結構分析提供了寶貴的資
2、源?！娟P鍵詞】擬南芥；cDNA擬南芥因其具有個體小，世代周期短和轉化率高等特點，因此在植物研究中被廣泛的作為一種模式生物。為了將擬南芥的小基因組測序，日本、歐洲和美國的科學家共同合作完成了擬南芥基因組測序工程。擬南芥5條染色體中的2條（2號和4號染色體，不包括核仁組織區(qū)和著絲點區(qū)）在1991年進行了測序，其余3條染色體在2000年進行了測序。2001年5月，大約127,000個擬南芥表達序列標簽（ESTs）被提交到EST數據庫（dbEST）。其中的序列來自法國，美國和日本共同合作的大范圍EST工程。這些工程已從不同的組織、器官、種子和發(fā)育
3、階段的擬南芥中獲得EST數據。然而，這些基于cDNA文庫的EST工程中的大部分的插入片段都不是全長的。ESTs有助于為表達基因提供標簽，大圣無法進行基因功能的進一步研究。因此，全基因組范圍的獲得表達基因的全長cDNA,對于在功能基因組學領域中分析基因及其產物的表達標簽和功能是十分重要的。1.擬南芥全長cDNA文庫的構建目前已應用biotinylatedCAPtrapper法建立了擬南芥的全長cDNA文庫。最近，研究人員有將trehalose-ther-moactivated反轉錄酶應用到CAPtrapper法中，構建了不同處理的擬南芥全長
4、cDNA文庫。在文庫構建中使用了入ZAP和XFLC載體。XFLC載體適合較大長度范圍的cDNAs,并且有利于較長cDNA片段的高效率克隆。入FLC載體也可通過Cre-lox-based系統(tǒng)被大量檢測，而不受質粒文庫的片段大小的限制。在RIKEN擬南芥全長文庫（RAFL）12、13、14、15、16、17、18、19和21的構建中，應用單鏈連接方法用DNA連接酶將雙鏈（ds）cDNA接頭連接到單鏈全長（ss）cDNA上。通過將5'端單向測序數據定位到基因組序列，研究人員將155,144個RAFLcDNA克隆聚合成14,668個cDNA類。去
5、除掉GC尾巴以便隨后的測序和將全長cDNA翻譯成蛋白。在構建全長cDNA文庫（RAFL11、12、13、14、17、18、19和21）中，進行了均一化和消減處理，以減少高表達的mRNAs的富集和去除在單向測序中已分類的cDNAso這種方法建立在全長cDNA的第一條鏈與若干RNA驅趕子雜交的基礎上，包括將起始mRNA作為標準化的驅趕子，將來自重排的克隆中完全轉錄的轉錄本作為消減子。這種方法會顯著促進新的cDNAs的發(fā)現。cDNA文庫制備的整個策略，包括標準化、均一化和消減文庫，在之前已發(fā)布。研究人員以處于不同發(fā)育階段的擬南芥各組織為材料，經
6、不同脅迫條件、激素和圖同光照條件處理，共構建了19個全長cDNA文庫。2.全長cDNA序列的結構和功能分析研究人員將cDNA克隆進行了3'端單向測序、將155,144個ESTs進行聚類，并且定位到擬南芥基因組上。最終，鑒定出14,668個非冗余RAFLcDNA克隆，并定位到擬南芥基因組上。這14,668個非冗余RAFLcDNA克隆具體信息在網上可見。如果擬南芥總共有25,00個基因，那么這些RAFL克隆應該可以占擬南芥全部基因的60%。通過單向測序349個RAFLcDNA克隆進行質量評價，表明其中98%的克隆包括起始密碼子和終止密碼子。因
7、此，研究人員用biotinylatedCAPtrapper法構建的cDNA文庫包括很高比例的全長基因。通過與擬南芥基因組序列的比較，從5'端測序的mRNA中可以獲得啟動子序列。從14,034個RAFLcDNA克隆中獲得了5'ESTs,并利用PLACE數據庫建立了一個啟動子數據庫。擬南芥啟動子數據庫表明，每個RAFLcDNA克隆5'末端上游lOOObp的基因組序列是植物中的300順式作用元件。從19個全長文庫中分離出的155,144個cDNA克隆進行了3，端單向測序。用這些單向測序數據進行了兩步聚類，在附錄方法中有詳細描述。在兩次聚類之后，
8、選擇質量最好的序列作為該類的代表。然后將每個代表性克隆的3'EST定位到擬南芥基因組上，在附錄中有描述。共獲得14,878條非冗余的代表性3'EST被定位到擬南芥基因組上。然后，對這14,87
