獲取基因全長(zhǎng)cDNA策略及應(yīng)用

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1、第29卷第2期健康研究V01．29NO．22009年4月HealthResearchApr．2009獲取基因全長(zhǎng)eDNA策略及應(yīng)用邵玨，邵玉鎖，曹明富(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州310036)摘要：全長(zhǎng)cDNA是研究基因功能的關(guān)鍵，獲得全長(zhǎng)cDNA也是基因組研究的重要內(nèi)容之一，本文概述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外獲取未知基因eDNA全長(zhǎng)的理論及其應(yīng)用。關(guān)鍵詞：全長(zhǎng)eDNA；mRNA；PCR；進(jìn)展中圖分類號(hào)：Q73文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008—4894(2009)02—0140—03模式植物結(jié)構(gòu)基因組的相繼闡明，多種植物了擬南芥雄性不育基因BnMs2；Pan等分離到了高密度分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)

2、建、大片段DNA克一個(gè)新的水稻細(xì)胞色素P450基因CYP81A6，這個(gè)隆系統(tǒng)的建立，序列測(cè)定技術(shù)和基因遺傳轉(zhuǎn)化技基因?qū)?種除草劑具有抗性；Paul等在擬南芥中術(shù)的發(fā)展，使得更多未知基因的克隆成為可能，同分離到了與擬南芥根尖鋁元素運(yùn)輸和敖合相關(guān)的基時(shí)也為后基因組時(shí)代提供了更富有挑戰(zhàn)性的任因ALS1—1。務(wù)。不論功能基因組學(xué)多么深?yuàn)W，其認(rèn)識(shí)基因功能的基本前提是獲取可能有相關(guān)功能的基因之全2轉(zhuǎn)座子或T·DNA標(biāo)簽法(transposonorT-DNA長(zhǎng)編碼序列。其中，全長(zhǎng)cDNA序列的獲取是正確taggingmethod)地注釋基因組序列、進(jìn)行基因的功能及產(chǎn)物分析此法的基本程序?yàn)椋菏紫冗M(jìn)行突變體的

3、誘變和的必要前提。本文就獲取基因全長(zhǎng)cDNA策略及鑒定工作，然后以轉(zhuǎn)座子或T-DNA作為標(biāo)簽DNA應(yīng)用進(jìn)行綜述。制成探針或引物，篩選突變體基因組文庫(kù)，用反義PCR(IPCR)技術(shù)分離出標(biāo)簽DNA兩側(cè)目的基因部1圖位克隆技術(shù)(map-basecloningorpositional分序列，再依據(jù)序列設(shè)計(jì)探針或引物篩選野生型基cloning)因組文庫(kù)，即可分離出完整的基因，最后用基因互補(bǔ)其基本工作思路為：首先將目的基因精確定位測(cè)驗(yàn)檢測(cè)其功能?，F(xiàn)在又發(fā)展了一種轉(zhuǎn)座子捕捉在分子標(biāo)記連鎖圖上，利用與目的基因緊密連鎖的(transposontraps)的手段來(lái)捕捉那些無(wú)表型突變的標(biāo)記篩選大片段DNA文庫(kù)(

4、如YAC、BAC、TAC、基因，包括有增強(qiáng)子捕捉和基因捕捉兩種類型。在PAC或cosmid文庫(kù))，并構(gòu)建含目的基因區(qū)域的精植物中利用的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有Ae／Ds、Mutator等，其細(xì)物理圖譜，利用該物理圖譜采用染色體步行中以Ac／Ds雙因子系統(tǒng)利用最多。目前應(yīng)用該方(chromosomewalking)的方法逐步逼近目的基因。法已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圓斑病基因圖位克隆法首先被應(yīng)用于模式植物擬南芥(Arobi-Hml，Hm2，番茄抗葉霉病基因Cf-2，Cf-4，Cf-5，Cf-9dopsisthaliana)。應(yīng)用該方法，傅廷棟等¨成功分離及Cf．ECP2等。黃海寧等應(yīng)用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法收稿

5、日期：2008—12—19作者簡(jiǎn)介：邵玨(1983一)，女，浙江杭州人，碩士研究生，專業(yè)：遺傳學(xué)。通信作者：曹明富(1955一)，男，浙江海寧人，教授，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域：細(xì)胞生物學(xué)與毒理遺傳學(xué)。第2期邵玨，等：獲取基因全長(zhǎng)cDNA策略及應(yīng)用141克隆了對(duì)陰溝腸桿菌B8中與抗水稻白葉枯病菌拮面：一是基因表達(dá)種類的不同，二是基因表達(dá)水平的抗活性相關(guān)的DNA片段。不同。差異表達(dá)基因克隆技術(shù)一般需要兩種或兩種以上不同的組織群體，其中一種或幾種是目的基因3同源序列法(homology-basedcandidategene不表達(dá)或異常表達(dá)([+])，而另一種是目的基因正method)常表達(dá)([一])

6、，然后制備兩種不同的mRNA，反轉(zhuǎn)其基本思路分為兩種：①根據(jù)基因家族各成員錄PCR并制備兩種cDNA探針，分別與表達(dá)目的基間保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并用簡(jiǎn)并引物對(duì)因的cDNA文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選，選出只與[+]探針含有目的基因的DNA文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)雜交而不與[一]探針雜交的克隆，或與[+]探針高PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和功能鑒定。②生物度雜交而與[一]探針雜交信號(hào)很弱的克隆，從而檢的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)測(cè)出特異表達(dá)的克隆，并進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)功的序列，基于此原理，在其它種屬同源基因被克隆的能研究。郭賓會(huì)等利用DDRT-PCR(mRNA差前提下，構(gòu)建cDN

7、A文庫(kù)或基因組文庫(kù)，然后用已知異顯示技術(shù))于苗期進(jìn)行水分脅迫誘導(dǎo)檢出l5個(gè)分子高保守序列制備同源探針，經(jīng)標(biāo)記后從相應(yīng)的陽(yáng)性克隆，l1個(gè)片段序列與已知序列有較高的同源文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，并經(jīng)核酸序列分析鑒定所克性，4個(gè)片段同源性非常低，可能為新基因。田振東隆的基因。應(yīng)用此方法，Tang等利用擬南芥同等用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)馬鈴源序列克隆到了DsFAD3，DsFAD7和DsFAD8的全薯富集晚疫病