梨S22RNase基因全長cDNA克隆與序列分析

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1、-------Wenzhou,ZHejiang325006；2TheKeyLabofNon-WoodForestProductofForestry Ministry,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology，ChangshaHunan 410004)Abstract:A840bpsequenceofS-RNasegenewasisolatedbyrapidamplificationof cDNAends.Sequencingresultsshowedthatthefragmentwas60%-90%similarityto thecD

2、NAsequencesofpearotherS-RNasealleles.Aopenreadingframecomprised by681bpencoding227aminoacidwasalsofound.Keyword:Pyruspyrifolia；self-incompatibility；Full-LengthcDNA；Cloning自交不親和性是植物實現(xiàn)異花受精、防止近親繁殖和退化的一種重要而精密的遺傳機(jī)制[1,2]。梨自交不親和是由單個基因位點（S基因位點）的復(fù)等位基因（S-RNase基因,簡稱S基 因）所控制[3,4]。日本學(xué)者于1995和1998年從本國的5個梨品種中分

3、離克隆到了7個S基 因的全長cDNA[5,6]，2002年又克隆了S8的全長cDNA[7]，2004年克隆到了S9的全長cDNA[8]。 國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)了30多個新的梨S基因，但絕大多數(shù)都為基因片段。對于全長cDNA序列的獲得可以更好的研究梨自交不親和S基因在mRNA水平上的差異，更好的獲得其編碼序列的真實情況，驗證基因組水平上獲得的S基因外顯子的可靠性和內(nèi)含子插入?yún)^(qū)域的準(zhǔn)確性。作者用沙梨品種云南寶珠，提取雌蕊總RNA，并用RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了S22-RNase的全長 cDNA序列。本文報道了S22-RNase全長cDNA的獲得和序列分析情況。1材料與方法1.1材料植物材料砂

4、梨（Pyruspyrifolia）品種云南寶珠雌蕊采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹所，置于液氮中帶回實驗室于-70℃保存待用。ExTaq、pMD18-TVector和3′-FullRaceCoreSet試劑盒購自日本TaKaRa公司,RNA抽提試劑盒購自invitrogen，回收試劑盒購自安比奧生物技術(shù)公司。其它藥品購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1.2方法1.2.1總RNA的提取參照RNA抽提試劑盒說明書，所用試劑用0.5‰DEPC處理過的無菌水配制。操作過程盡量避免RNase污染，耐高溫器皿240℃烘烤4小時以上，其它器皿用0.5‰DEPC溶液浸泡過夜，然后高溫滅菌處理，烘干備用。1

5、.2.2引物設(shè)計及cDNA全長獲得參考GenBank上蘋果、梨的mRNA序列，利用PrimerPremier5.0設(shè)計5′端特異引物為：PF2：5′-TGCCTCGCTCTTGAACAAA-3′和PF1：5′-TTTACGCAGCAATATCAG-3′，PF1位于PF2下游120bp左右處。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10×RNAPCRBuffer1μl，MgCl2(25mM)2μl, dNTPMixture(各10mM)，AMVReverseTranscriptaseXL(5U/μl)0.5μl,RNaseInhibitor(40U/μl)0.25μl,Oligodt-3sitesAdapto

6、rPrimer(2.5μM)0.5μl,PositiveControlRNA(2×105copies/μl)0.5μl,RNaseFreedH2O。循環(huán)條件如下：30℃10min,50℃30min,95℃5min，5℃5min1個循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行一下反應(yīng)：10×PCRBuffer（Mg2+Free）4μl,MgCl2(25mM)3μl,TaKaRaTaq (5U/μl)0.25μl,PF2(10μM)1μl,3sitesAdaptorPrimer(20μM)0.5μl,上步的反應(yīng)液10μl,滅菌水33.75μl.循環(huán)條件：94℃30sec，55℃30sec，72℃2min38

7、個循環(huán)。1.2.3目的片段回收、克隆PCR產(chǎn)物回收按照AmbiogenLifeTechLtd的PuprepGelExtractionKit操作，回收產(chǎn)物與pMD18-TVector(TaKaRa)過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a,涂布于含有IPTG、X-gal、Amp的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜。挑取白色單克隆于5mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過夜。抽提質(zhì)粒DNA，送上海生工測序。-----------64-----------2