[精品]實(shí)驗(yàn)五、酵母的活菌觀察及活細(xì)胞計(jì)數(shù).doc

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1、實(shí)驗(yàn)五、酵母的活菌觀察及活細(xì)胞計(jì)數(shù)—、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、認(rèn)識(shí)釀酒酵母的形態(tài)特征。2、了解微生物細(xì)胞活體染色的原理，能辨別釀酒酵母的死活。3、學(xué)校血細(xì)胞計(jì)數(shù)法的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理：將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的微生物細(xì)胞或砲了懸液，加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的技數(shù)室屮，在顯微鏡下逐格計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是固定的（0.1mm3）,故可將在顯微鏡下計(jì)得的菌體細(xì)胞數(shù)（或抱了數(shù)）換算成單位體積試樣屮的含菌量。此法計(jì)得的數(shù)值為樣品屮的死菌數(shù)和活菌數(shù)的總和，故稱其為總菌計(jì)數(shù)法。2、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：是一塊特制的精密載玻片，在載玻片上有四條長(zhǎng)槽，將玻片屮央?yún)^(qū)域分隔成3個(gè)平

2、臺(tái)，中問(wèn)平臺(tái)比兩邊的平臺(tái)低0.1mm,此平臺(tái)屮間又有一條短槽將其分隔成2個(gè)短平臺(tái)，在2個(gè)平臺(tái)上各有一個(gè)相同的方格網(wǎng)。它被劃分為9個(gè)大格，其中央大格即為計(jì)數(shù)室。該計(jì)數(shù)室又被精密地劃分為400個(gè)小格，但計(jì)數(shù)室還有25個(gè)中格（為16小格海中格）或16個(gè)中格（為25小格/每中格）兩種，每中格的四周均有雙線界限標(biāo)志，以便在顯微鏡下區(qū)分。因此兩種屮格類型計(jì)數(shù)室的總體積是一樣的。即計(jì)數(shù)室大方格的邊長(zhǎng)為1mm,故面積為lmmlj計(jì)數(shù)室與蓋玻片間的深度為0.1mm,所以計(jì)數(shù)室的體積為0.1mm30計(jì)數(shù)時(shí)，先計(jì)得若干屮格（一般為5個(gè)）中格內(nèi)的含菌數(shù)，再求得每屮格菌數(shù)的平均值，

3、然后乘上中格數(shù)（16或25）,就可得出1大方格（O.lmn?）計(jì)數(shù)室屮的總菌數(shù)，若再乘上104（換算成每汕的含菌量）及菌液的稀釋倍數(shù)，即可算岀每mL原菌液中的總菌數(shù)值。算術(shù)計(jì)算法：菌數(shù)（個(gè)/mL）=（xi+x2+x3+X4+x5）/5X25（或16）X104X稀釋倍數(shù)3、4、活體染色法：活體染色法就是用對(duì)微生物無(wú)毒性的染料（如美蘭、剛果紅、屮性紅等染料）配成一定的濃度，，再與一定量的菌液混合，經(jīng)一段時(shí)間后死菌和活菌會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色，這樣便可以在顯微鏡下區(qū)分活菌數(shù)和死菌數(shù)。美蘭：美蘭是常用的活體染色染料，當(dāng)它處于氧化態(tài)時(shí)呈藍(lán)色,還原態(tài)時(shí)為無(wú)色。川它進(jìn)行活體染

4、色時(shí),由于活細(xì)胞代謝過(guò)程屮的脫氫作用，美蘭接受氫示就由氧化態(tài)轉(zhuǎn)變成還原態(tài)，因此活細(xì)胞呈現(xiàn)為無(wú)色,而衰老或死亡的細(xì)胞由于代謝緩慢或停止，不能使美蘭還原，故細(xì)胞呈淡藍(lán)色或藍(lán)色。三、實(shí)驗(yàn)材料和器1111（1）菌種：釀酒酵母（2）試劑：內(nèi)裝玻璃珠的三角瓶，PH7磷酸鹽緩沖液，美蘭染色液（3）儀器：顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，配套的技數(shù)板厚蓋玻片等（4）器1111：試管，移液管，滴管（5）其他：擦鏡紙，吸水紙等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、制備酵母菌菌液：取在麥芽汁斜面上培養(yǎng)48h的釀酒酵母一支，川1（）譏pH7.0磷酸鹽緩沖液將菌苔洗下，倒入含有玻璃珠的三角瓶屮，充分振蕩，以分散細(xì)胞

5、。再將菌液稀釋20（）倍。2、活體染色：取美蘭液0.9mL于試管屮，再取上述菌液0.1mL相混合，染色lOmin后進(jìn)行計(jì)數(shù)。3、yeast染色觀察：制片（水浸片）低倍鏡觀察高倍鏡（40X）（注：觀察細(xì)胞形狀、4、出芽方式及細(xì)胞的死活）清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：先用門來(lái)水沖洗（切勿用硬刷了洗刷），再用95%乙醇棉球輕輕擦洗麻用水沖洗,最后用吸水紙吸T?（切忌在煤氣燈上烘烤而導(dǎo)致計(jì)數(shù)板破裂）。經(jīng)鏡檢確證計(jì)數(shù)室上無(wú)污染或粘附的微生物細(xì)胞后才可以使用。蓋玻片也做同樣的清潔處理。5、加菌液：將計(jì)數(shù)板的蓋玻片放于計(jì)數(shù)室上血兩邊的平臺(tái)架上，用細(xì)口滴管將菌液來(lái)回吸吹數(shù)次，使菌液充

6、分混勻并使滴管內(nèi)壁吸附完全后，立即吸取少最酵母菌懸液滴加在蓋玻片與計(jì)數(shù)板的邊緣縫隙處，讓菌液沿蓋玻片與計(jì)數(shù)板間的縫隙滲入計(jì)數(shù)室（避免計(jì)數(shù)室內(nèi)產(chǎn)生氣泡）。再用銀了輕碰一下蓋玻片，以免因菌液過(guò)多將蓋玻片浮起而改變計(jì)數(shù)室的容積。靜置片刻,待菌體白然沉降與穩(wěn)定麻,可在顯微鏡下選擇中格區(qū)并逐格計(jì)數(shù)。6、計(jì)總菌數(shù)：先在低倍鏡下（視野宜暗些）尋找計(jì)數(shù)板大方網(wǎng)格，再在大方網(wǎng)格小央尋找計(jì)數(shù)室并將其移至視野的屮央，轉(zhuǎn)川高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。為了減少計(jì)數(shù)屮的誤并，所選的屮格位置及樣品含菌量均應(yīng)具代表性，通常選取25屮格計(jì)數(shù)室內(nèi)的5格即4個(gè)角與中央計(jì)取其含菌量。為提高精確度，每個(gè)樣品

7、必須重復(fù)計(jì)數(shù)2?4個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)的含菌量，若誤差在統(tǒng)計(jì)的允許范I韋I內(nèi)，則可求其平均值。7、清洗：計(jì)數(shù)完畢，計(jì)數(shù)板先用蒸僭水沖洗，吸水紙吸干，再用乙醉棉球輕輕擦拭后水沖，最后用擦鏡紙擦干。計(jì)數(shù)室上的蓋玻片亦作同樣的清洗和擦干處理，最后放入計(jì)數(shù)板的盒屮。五、結(jié)果記錄1、釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)、出芽方式及細(xì)胞的死活經(jīng)美蘭染色觀察到活酵母菌為無(wú)色，死酵母菌為藍(lán)色。子囊砲子°一、釀酒酵母的砲子2、菌液濃度中格菌數(shù)屮格菌數(shù)（平均值）大格總菌數(shù)稀釋倍數(shù)菌數(shù)/（個(gè)-mLlX1X2*3X4x5567864585662.41.56X1072003.12X109六、注意事項(xiàng)1、計(jì)數(shù)室內(nèi)

8、不可有氣泡，否則將影響菌懸液隨機(jī)分布而使計(jì)數(shù)產(chǎn)生謀差。2、為了減少