活菌計數(shù)參考材料.doc

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1、細(xì)菌計數(shù)參考材料一、檢樣稀釋　　1、以無菌操作用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1∶100的稀釋液?！?、另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管?！?、根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。二、基本原理　　平板菌落計數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個菌落即代表一個單細(xì)胞。計數(shù)時，先將待測樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)

2、基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。　　這種計數(shù)法的優(yōu)點是能測出樣品中的活菌數(shù)。三、器材　　大腸桿菌懸液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，1ml無菌吸管，無菌平皿，盛有9ml無菌水的試管，試管架和記號筆等。四、操作步驟　　1、編號：取無菌平皿9套，分別用記號筆標(biāo)明10-6、10-7各2套。另取7支盛有9ml無菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10－7。2、稀釋　　用1ml無菌吸管精確地吸取1ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，另取1支吸管將管內(nèi)懸液來回吸吹三次，吸時伸

3、入管底，吹時離開水面，使其混合均勻。換一支吸管自10-1試管吸1ml放入10-2試管中，吸吹三次，……其余依次類推。整個稀釋過程如圖Ⅷ-3。　　3、取樣　　用3支1ml無菌吸管分別精確地吸取10-6、10-7的稀釋菌液0．1ml，對號放入編好號的培養(yǎng)皿中?！　?、計數(shù)　　培養(yǎng)24小時后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計算：　　每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10　　一般選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋度計算每毫升的菌數(shù)最為合適。同一稀釋度的三個重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。由10-6、10-7兩個稀釋度計算出的每毫升菌液中

4、總活菌數(shù)也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗不精確。　　平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好?！　∑桨寰溆嫈?shù)法的操作是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃溫室中烘烤30分鐘左右，使其干燥，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種于不同稀釋度編號的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，再用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20—30分鐘，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后再倒置于37℃的溫室中培養(yǎng)。五、無菌操作的基本要求1、試驗開始前，應(yīng)以濕式方法清潔臺面和打掃室內(nèi)地面，然后以紫外線或其他方

5、法對實驗室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒；2、實驗人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、帽子；進(jìn)行無菌檢驗時，需經(jīng)風(fēng)淋后進(jìn)入實驗室，然后，正確穿戴好無菌隔離衣、帽和口罩；3、每吸取一次不同樣液應(yīng)更換無菌吸管，接種環(huán)（針）需在火焰上燒灼滅菌后，才可再次使用；4、要求無菌的試劑，如蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)硬水、中和劑等，均需滅菌或過濾除菌；5、無菌器材和試劑，使用前須檢查容器或包裝是否完整，有破損者不得使用；6、正在使用的無菌器材和試劑不得長時間暴露于空氣中；7、移液或接種時，應(yīng)將試管口和瓊脂平板靠近火焰，防止污染；8、所有用過的污染器材，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器中，以防止對周圍環(huán)境和清潔

6、物品造成污染；9、若不慎發(fā)生微生物培養(yǎng)物摔碎或其他試驗微生物泄漏事故時，不論是否具有致病性，均應(yīng)立即對污染及可能波及的區(qū)域進(jìn)行消毒處理；10、全部試驗結(jié)束后，應(yīng)按常規(guī)對室內(nèi)空氣和環(huán)境表面進(jìn)行消毒處理。六、活菌培養(yǎng)計數(shù)技術(shù)1、適用范圍測定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。2、試驗器材（1）刻度吸管（1.0ml、10.0ml）。（2）稀釋液：（3）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：3、操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗中的活菌培養(yǎng)計數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。（1）對菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)。洗菌時，一般以稀釋液為洗液。具體

7、方法如下:取含5.0ml稀釋液無菌試管，對菌片或小型固體樣本直接投入即可，對棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲80次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上，每管加入4.5ml稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上10-1、10-2、10-3......等。（3）將菌懸液樣本在用電動混合器混合20s（或在手掌上