曹鳳明-微生物活菌計數方法

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1、微生物活菌平板計數方法和技術微生物肥料和食用菌菌種質檢中心曹鳳明微生物計數方法種類直接計數法核酸計數法活菌計數法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數法混菌法平板技術法直接計數法1.顯微鏡直接計數比濁法3.電子計數器計數法1.顯微鏡直接計數顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液血球計數板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細菌計數板：一般細菌用途：快速了解發(fā)酵液的菌數。常用于生產線上生產過程控制。缺點：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計數與真實菌數有很大差異。不能作為正規(guī)計數方法。2.比濁法根據菌懸液的透光量間接地測定細菌的數量。細

2、菌懸浮液的濃度在一定范圍內與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。根據濁度計算出細菌的數量。該方法一般可以估計出細菌的數量級。經常用于一些特殊的微生物的快速計數，如光合細菌和藻類的測數。但是由于該方法僅能估測菌數，不能準確定量，而且由于一些顆粒和添加劑的作用，不能正確反映該樣品的質量，所以在質檢過程中不予采用。3.電子計數器計數法工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。該法測定結果較準確，但它只識別顆粒

3、大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產品的檢測。核酸計數法每一種生物都有一套自己獨有的遺傳物質，脫氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。隨著核酸分析技術的發(fā)展，已經能夠利用遺傳物質對生物進行定性和定量的測定，而且更為靈敏、迅速、專一性強。常用的方法：熒光定量PCR此法操作精細繁瑣，藥品昂貴，而且經常受到死菌體的干擾。暫時不能成為微生物肥料活菌計數的常用方法，活菌計數法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數法（主要用于光合細菌和（糞）大腸菌群的測定）混菌法（適用于兼性厭氧微生物的測定）取1

4、.0mL不同稀釋度菌懸液于滅菌平皿內，將冷卻至50℃左右的15~20mL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內輕輕混勻，培養(yǎng)計數。（食品中乳酸菌總菌數的測定）平板計數法（最常用的方法）平板計數法使不可見的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長成為可見的菌落（CFU），從而可用肉眼進行觀察、計數。較其他方法直觀準確，是一種經典的檢測活菌數的方法，也是目前國際上通用的方法。制備一定體積的菌懸液，作一系列的倍數稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據培養(yǎng)出的菌落數，計算出樣品中的活菌數。平板計數法示意圖平板計數的優(yōu)缺點優(yōu)點：直觀、準確、可靠該方法不僅可以檢測到樣品中的有效活菌數，而且可以檢測到

5、產品的微生物污染情況，即雜菌數。缺點：由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得的結果一般低于實際值。平板計數法（一）檢測前的準備（二）操作過程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識別、計數）（三）計算（一）檢測前的準備根據菌種的特性選擇方法天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等無菌間或潔凈工作臺消毒吸管、刮刀、培養(yǎng)皿的洗滌、包扎、滅菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌培養(yǎng)基制備和平板制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基定義指人工方法配合而成的，專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的選擇需要了解目的微生物的基本特性，選擇正確的培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)基的制備程序按《微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術條件》規(guī)定執(zhí)行，NY/T1114-2006培養(yǎng)基標識清晰，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。檢測前的準備平板制備滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右（以不燙手為宜），在無菌狀態(tài)下傾注培養(yǎng)基。傾倒平板前應將培養(yǎng)基搖勻，防止在瓶底有沉淀。但是搖動時要防止產生大量氣泡。通常條件下平板制備好后室溫放置或溫箱放置2~3天使用，目的：一可以檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過程被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，防止菌落由于平板上的水滴運動而連片以致無法計數。檢測前的準備（二）操作過程2.1母液制備2.2系列稀釋、加樣和涂布2.3培養(yǎng)2.

7、4識別和計數2.1母液（基礎液）的制備樣品混合均勻：很重要固體樣品：稱取10g左右樣品加入到100mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。液體樣品：量取10.0ml樣品加入到90mL無菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。分散菌體：將三角瓶置于搖床上200r/min振蕩30min，即成母液菌懸液。2.2樣品稀釋、加樣和涂布準備工作：應將平板上做好標記，包括培養(yǎng)基種類，樣品編號，稀釋度/稀釋倍數.將小瓶無菌水寫好樣品編號、稀釋度/稀釋倍數具體過程見GB20287-2006農用微生物菌劑2.2.1系列稀釋用無菌吸管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加

8、至45mL無菌水（150mL三角瓶）中