曹鳳明-微生物活菌計(jì)數(shù)方法

《曹鳳明-微生物活菌計(jì)數(shù)方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。

1、微生物活菌平板計(jì)數(shù)方法和技術(shù)微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)檢中心曹鳳明微生物計(jì)數(shù)方法種類直接計(jì)數(shù)法核酸計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)法（培養(yǎng)法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能數(shù)法混菌法平板技術(shù)法直接計(jì)數(shù)法1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)比濁法3.電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液血球計(jì)數(shù)板：菌體較大的酵母菌或霉菌孢子細(xì)菌計(jì)數(shù)板：一般細(xì)菌用途：快速了解發(fā)酵液的菌數(shù)。常用于生產(chǎn)線上生產(chǎn)過(guò)程控制。缺點(diǎn)：不易區(qū)分顆粒、死菌體和雜菌，計(jì)數(shù)與真實(shí)菌數(shù)有很大差異。不能作為正規(guī)計(jì)數(shù)方法。2.比濁法

2、根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。根據(jù)濁度計(jì)算出細(xì)菌的數(shù)量。該方法一般可以估計(jì)出細(xì)菌的數(shù)量級(jí)。經(jīng)常用于一些特殊的微生物的快速計(jì)數(shù)，如光合細(xì)菌和藻類的測(cè)數(shù)。但是由于該方法僅能估測(cè)菌數(shù)，不能準(zhǔn)確定量，而且由于一些顆粒和添加劑的作用，不能正確反映該樣品的質(zhì)量，所以在質(zhì)檢過(guò)程中不予采用。3.電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過(guò)這個(gè)小孔時(shí)，電阻明

3、顯增加，形成一個(gè)脈沖，自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但它只識(shí)別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。不適于微生物肥料產(chǎn)品的檢測(cè)。核酸計(jì)數(shù)法每一種生物都有一套自己獨(dú)有的遺傳物質(zhì)，脫氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。隨著核酸分析技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)能夠利用遺傳物質(zhì)對(duì)生物進(jìn)行定性和定量的測(cè)定，而且更為靈敏、迅速、專一性強(qiáng)。常用的方法：熒光定量PCR此法操作精細(xì)繁瑣，藥品昂貴，而且經(jīng)常受到死菌體的干擾。暫時(shí)不能成為微生物肥料活菌計(jì)數(shù)的常用方法，活菌計(jì)數(shù)法（培養(yǎng)法）MPN（Most-

4、Probable-Number）最大可能數(shù)法（主要用于光合細(xì)菌和（糞）大腸菌群的測(cè)定）混菌法（適用于兼性厭氧微生物的測(cè)定）取1.0mL不同稀釋度菌懸液于滅菌平皿內(nèi)，將冷卻至50℃左右的15~20mL培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕混勻，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（食品中乳酸菌總菌數(shù)的測(cè)定）平板計(jì)數(shù)法（最常用的方法）平板計(jì)數(shù)法使不可見(jiàn)的微生物在人工培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)成為可見(jiàn)的菌落（CFU），從而可用肉眼進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)。較其他方法直觀準(zhǔn)確，是一種經(jīng)典的檢測(cè)活菌數(shù)的方法，也是目前國(guó)際上通用的方法。制備一定體積的菌懸液，作一系列的倍數(shù)稀釋，然后將定量的稀

5、釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算出樣品中的活菌數(shù)。平板計(jì)數(shù)法示意圖平板計(jì)數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、準(zhǔn)確、可靠該方法不僅可以檢測(cè)到樣品中的有效活菌數(shù)，而且可以檢測(cè)到產(chǎn)品的微生物污染情況，即雜菌數(shù)。缺點(diǎn)：由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的局限性，所得的結(jié)果一般低于實(shí)際值。平板計(jì)數(shù)法（一）檢測(cè)前的準(zhǔn)備（二）操作過(guò)程（母液制備、系列稀釋、加樣、涂布、培養(yǎng)、菌落識(shí)別、計(jì)數(shù)）（三）計(jì)算（一）檢測(cè)前的準(zhǔn)備根據(jù)菌種的特性選擇方法天平，搖床，酒精燈，培養(yǎng)箱，染色液，顯微鏡，滅菌鍋，烘箱等無(wú)菌間或潔凈工作臺(tái)消毒吸管、刮刀、培養(yǎng)皿的洗滌、包扎、滅

6、菌制樣和稀釋用三角瓶水制備、滅菌培養(yǎng)基制備和平板制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基定義指人工方法配合而成的，專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的選擇需要了解目的微生物的基本特性，選擇正確的培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備程序按《微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件》規(guī)定執(zhí)行，NY/T1114-2006培養(yǎng)基標(biāo)識(shí)清晰，培養(yǎng)基名稱，配制日期等。檢測(cè)前的準(zhǔn)備平板制備滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右（以不燙手為宜），在無(wú)菌狀態(tài)下傾注培養(yǎng)基。傾倒平板前應(yīng)將培養(yǎng)基搖勻，防止在瓶底有沉淀。但是搖動(dòng)時(shí)要防止產(chǎn)生大量氣泡。通常條件下平板制備好

7、后室溫放置或溫箱放置2~3天使用，目的：一可以檢查培養(yǎng)基是否滅菌徹底，是否在傾倒過(guò)程被微生物污染；二為了使平板表面干濕適宜，防止菌落由于平板上的水滴運(yùn)動(dòng)而連片以致無(wú)法計(jì)數(shù)。檢測(cè)前的準(zhǔn)備（二）操作過(guò)程2.1母液制備2.2系列稀釋、加樣和涂布2.3培養(yǎng)2.4識(shí)別和計(jì)數(shù)2.1母液（基礎(chǔ)液）的制備樣品混合均勻：很重要固體樣品：稱取10g左右樣品加入到100mL無(wú)菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。液體樣品：量取10.0ml樣品加入到90mL無(wú)菌水（500mL三角瓶）中，靜置20min。分散菌體：將三角瓶置于搖床上200

8、r/min振蕩30min，即成母液菌懸液。2.2樣品稀釋、加樣和涂布準(zhǔn)備工作：應(yīng)將平板上做好標(biāo)記，包括培養(yǎng)基種類，樣品編號(hào)，稀釋度/稀釋倍數(shù).將小瓶無(wú)菌水寫好樣品編號(hào)、稀釋度/稀釋倍數(shù)具體過(guò)程見(jiàn)GB20287-2006農(nóng)用微生物菌劑2.2.1系列稀釋用無(wú)菌吸管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加至45mL無(wú)菌水（150mL三角瓶）中