活菌計(jì)數(shù)參考材料.doc

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1、細(xì)菌計(jì)數(shù)參考材料一、檢樣稀釋　　1、以無(wú)菌操作用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1∶100的稀釋液?！?、另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管?！?、根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。二、基本原理　　平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說(shuō)一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測(cè)樣品作一系列稀釋?zhuān)偃∫欢康南♂尵航臃N到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)

2、基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)?！　∵@種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。三、器材　　大腸桿菌懸液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，1ml無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，盛有9ml無(wú)菌水的試管，試管架和記號(hào)筆等。四、操作步驟　　1、編號(hào)：取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-6、10-7各2套。另取7支盛有9ml無(wú)菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10－7。2、稀釋　　用1ml無(wú)菌吸管精確地吸取1ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，另取1支吸管將管內(nèi)懸液來(lái)回吸吹三次，吸時(shí)伸

3、入管底，吹時(shí)離開(kāi)水面，使其混合均勻。換一支吸管自10-1試管吸1ml放入10-2試管中，吸吹三次，……其余依次類(lèi)推。整個(gè)稀釋過(guò)程如圖Ⅷ-3?！　?、取樣　　用3支1ml無(wú)菌吸管分別精確地吸取10-6、10-7的稀釋菌液0．1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的培養(yǎng)皿中?！　?、計(jì)數(shù)　　培養(yǎng)24小時(shí)后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：　　每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10　　一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30—300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的菌數(shù)最為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。由10-6、10-7兩個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中

4、總活菌數(shù)也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗(yàn)不精確?！　∑桨寰溆?jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個(gè)稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好?！　∑桨寰溆?jì)數(shù)法的操作是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃溫室中烘烤30分鐘左右，使其干燥，然后用無(wú)菌吸管吸取0.1ml菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，再用無(wú)菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20—30分鐘，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后再倒置于37℃的溫室中培養(yǎng)。五、無(wú)菌操作的基本要求1、試驗(yàn)開(kāi)始前，應(yīng)以濕式方法清潔臺(tái)面和打掃室內(nèi)地面，然后以紫外線或其他方

5、法對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒；2、實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、帽子；進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)時(shí)，需經(jīng)風(fēng)淋后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，然后，正確穿戴好無(wú)菌隔離衣、帽和口罩；3、每吸取一次不同樣液應(yīng)更換無(wú)菌吸管，接種環(huán)（針）需在火焰上燒灼滅菌后，才可再次使用；4、要求無(wú)菌的試劑，如蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)硬水、中和劑等，均需滅菌或過(guò)濾除菌；5、無(wú)菌器材和試劑，使用前須檢查容器或包裝是否完整，有破損者不得使用；6、正在使用的無(wú)菌器材和試劑不得長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中；7、移液或接種時(shí)，應(yīng)將試管口和瓊脂平板靠近火焰，防止污染；8、所有用過(guò)的污染器材，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器中，以防止對(duì)周?chē)h(huán)境和清潔

6、物品造成污染；9、若不慎發(fā)生微生物培養(yǎng)物摔碎或其他試驗(yàn)微生物泄漏事故時(shí)，不論是否具有致病性，均應(yīng)立即對(duì)污染及可能波及的區(qū)域進(jìn)行消毒處理；10、全部試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)按常規(guī)對(duì)室內(nèi)空氣和環(huán)境表面進(jìn)行消毒處理。六、活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)1、適用范圍測(cè)定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。2、試驗(yàn)器材（1）刻度吸管（1.0ml、10.0ml）。（2）稀釋液：（3）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：3、操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。（1）對(duì)菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。對(duì)菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。洗菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。具體

7、方法如下:取含5.0ml稀釋液無(wú)菌試管，對(duì)菌片或小型固體樣本直接投入即可，對(duì)棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上用力振敲80次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上，每管加入4.5ml稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上10-1、10-2、10-3......等。（3）將菌懸液樣本在用電動(dòng)混合器混合20s（或在手掌上