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《鰻弧菌金屬蛋白酶單克隆抗體的制備及鑒定.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、高技術(shù)通訊2003.2鰻弧菌金屬蛋白酶單克隆抗體的制備及鑒定d陳師勇i張培軍＠莫照蘭張振冬鄒玉霞徐永立（中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物學(xué)重點實驗室青島266071）摘要鰻弧菌M3胞外產(chǎn)物經(jīng)純化得到分子量為36.5kDa的金屬蛋白酶，濃縮后作為抗原免疫BALB／C小鼠。經(jīng)細(xì)胞融合及篩選，得到三株穩(wěn)定分泌抗金屬蛋白酶的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為P2B1、P4A3和P4B1。亞型鑒定結(jié)果表明，三株細(xì)胞株產(chǎn)生的單抗均為IgG3型。蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）分析顯示，所得到的單抗只與分子量為36.5kDa的金屬蛋白酶反應(yīng)，具有
2、較高特異性。三株單抗均能有效抑制蛋白酶活性。關(guān)鍵詞鰻弧菌，金屬蛋白酶，單克隆抗體析和HPLC凝膠色譜層析純化，最后得到電泳純的0引言蛋白。經(jīng)超濾杯濃縮至3mg／ml后作免疫動物抗原用。鰻弧菌（Vibrioanguillarum）是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖1.2實驗動物和細(xì)胞系流行性疾病的一種重要病原，曾經(jīng)在世界范圍內(nèi)引BALB／C純系小鼠，雌性，6～8周齡，購自中山起養(yǎng)殖魚類的流行病爆發(fā)［1，2］。在山東榮城尋山養(yǎng)醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，中魚場，我們從瀕臨死亡的患病牙鲆中分離出一株鰻山醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室惠贈?；?/p>
3、菌強毒性株M3［3］。實驗過程發(fā)現(xiàn)鰻弧菌M3的1.3動物免疫和細(xì)胞融合［4］首次免疫用抗原與弗氏完全佐劑按1：1的比例胞外產(chǎn)物（ECP）具有強致病性，并進(jìn)一步從ECP［5］混合乳化，腹腔注射BALB／C小鼠，每只鼠每次注中分離純化到一個毒性極強的金屬蛋白酶，其對射0.2ml，共注射4次。第二、第三次間隔兩周，用金魚的半數(shù)致死量（LD）為1.2蛋白／g體重。50＠g弗氏不完全佐劑乳化的等量抗原加強免疫，第四次為了解此蛋白酶在鰻弧菌致病過程中所起的作用，等量抗原不加佐劑直接注射進(jìn)行沖擊加強免疫。需要有特異性的抗體作為工具進(jìn)行研
4、究。在本文細(xì)胞融合、克隆參考朱立平方法［6］。中，我們以純化的蛋白酶為抗原，制備其單克隆抗1.4蛋白酶單抗的篩選———間接ELISA法體，并對單抗的性質(zhì)進(jìn)行了鑒定。用純化的0.1ml蛋白酶（0.15mg／ml）包被酶標(biāo)板，檢測時細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)1材料和方法記的羊抗鼠IgG為二抗，鄰苯二胺-過氧化氫底物溶液顯色后測OD值。4921.1抗原的制備1.5SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡免疫動物和篩選抗體用的鰻弧蛋白酶SDS-PAGE電泳、染色和蛋白質(zhì)印跡分菌金屬蛋白酶抗原均為本實驗室純［7］析（Western-B
5、lot）方法參照《分子克隆實驗指南》。化制備。鰻弧菌致病株的ECP經(jīng)濃縮膠為5%，分離膠為12%。蛋白質(zhì)印跡分析時，超濾杯（PALL公司，截留分子量1先經(jīng)SDS-PAGE電泳，將凝膠上標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳區(qū)切萬）濃縮后，經(jīng)SephadexG100凝膠下，用考馬斯亮蘭染色，余下部分凝膠用Biorad公層析、DEAE-cellulose離子交換層司的蛋白轉(zhuǎn)印裝置將分離的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖d973規(guī)劃（G1999012003）資助項目。i男，1976年生，博士生；研究方向：海洋生物技術(shù)，水產(chǎn)動物病害學(xué)。＠聯(lián)系人。（收稿日期：2002-0
6、8-01）—102—陳師勇：鰻弧菌金屬蛋白酶單克隆抗體的制備及鑒定維素薄膜上（100V轉(zhuǎn)印4h）。以單克隆抗體細(xì)胞培2.2金屬蛋白酶單抗細(xì)胞株的建立養(yǎng)上清作為一抗，過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG作為BALB／C小鼠經(jīng)4次免疫后，取脾細(xì)胞與SP2／二抗，加DAB（3，3*-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽）底物溶液0細(xì)胞融合，分配在5塊24孔板中培養(yǎng)。10天后所顯色。有的細(xì)胞培養(yǎng)孔都長出細(xì)胞克隆，經(jīng)ELISA分析，1.6蛋白酶活性抑制實驗：從中篩選到6個分泌蛋白酶抗體的陽性孔。陽性孔蛋白酶活性抑制實驗參照Noriko方法［8］。將內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)過
7、3次有限稀釋克隆化，得到3株生長0.025ml酶樣品、10mmol／Lp~8.0Tris-~Cl緩沖液良好并穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，分別命名為0.05ml與0.025ml單抗混勻，在室溫下孵育10minP2B1、P4A3和P4B1，其細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體的后，加入5mg／ml蛋白酶底物azocasein（Sigma）ELISA效價分別為1：2，1：10和1：20。0.1ml，28C反應(yīng)0.5h后，加0.7ml三氯乙酸終止反2.3蛋白質(zhì)印跡圖譜應(yīng)。離心取上清，加入等體積0.5mol／LNaO~，在鰻弧菌ECP經(jīng)SDS-PAG
8、E電泳分離，轉(zhuǎn)印至硝440nm波長下測光吸收值。對照實驗為只有酶樣酸纖維素薄膜后，與各個單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行免品和Tris-~Cl緩沖液共孵育。以對照組酶活力為疫印跡反應(yīng)。結(jié)果是，所制備的蛋白酶單抗P2B1、100%，測相對酶活力。P4A3和P4B1均僅與ECP中分子量為36.5kDa的1.7單克隆抗體
