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1、免疫熒光染色技術(shù)免疫熒光染色技術(shù)標(biāo)簽：熒光免疫染色技術(shù)2009-04-0722:28最近看了幾篇文章，文中都涉及一項技術(shù)叫：免疫熒光染色。感覺這項技術(shù)不錯，實驗的圖片經(jīng)過染色很漂亮，再一merge,史加說明問題，今日網(wǎng)上搜來有關(guān)介紹，惡補一下。竟覺也不是和特別，所謂難者不會，會者不難，人概也就是如此了。將該項技術(shù)介紹如下：（轉(zhuǎn)載）熒光免疫染色和DAPI染色實驗1.實驗原理免疫染色的實驗原理類似于WesternBlotting,兩考都是運川抗體的特異性識別作川來顯示日的蛋門，但是由于免疫染色需要在原位進行，而且蛋門沒
2、有經(jīng)過富集，因此其實驗難度較高。實驗的基木原理是：利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細胞固定，使得細胞膜的通透性人人增加，并且利用Triton-X-100使得一?部分膜蛋門變性，從而使通透性進一步加強。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋門先與血清內(nèi)的非特異性抗體結(jié)合，而特異性的抗體由于動力學(xué)的關(guān)系可以通過競爭性的反應(yīng)與日的蛋門結(jié)合，這一過程可以保證抗體識別的特異性。二抗可以特異性識別一?抗的Fc區(qū)域，利用二抗連接不同的熒光基團，就可以在熒光顯微鏡下觀察到不同的熒光，從而顯示日的基因的表達情況。另外，免疫熒光實驗由于
3、其較高的敏感性可以顯示岀基因表達的亞細胞情況（核內(nèi)，核外，膜上以及一些較人的細胞器上），所以通常被用來作為基因定位的方法。DAPI的中文名稱是4,6-聯(lián)瞇-2-苯基口引味，是一種常用的熒光染料，其作用機理與漠化乙錠(EB)等染色劑的機理類似：它們與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團的吸收峰是358nm而散射峰是461run,正好UV(紫外光)的激發(fā)波長是356nm,使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號。JagielskiM.et.Al在1976年首次運用該技
4、術(shù)檢測細胞培養(yǎng)中的支原體感染。后來隨著技術(shù)的進步，該技術(shù)被運川于各種微生物的檢測、生長監(jiān)測，胚胎發(fā)育過程的檢測，細胞周期的檢測和各種核定位的實驗。木實驗就是利用DAPI染色標(biāo)記細胞核的位置。免疫染色實驗方法和步驟免疫染色(immunolstaining)包括免疫熒光(inununolfluorescence)>免疫組化(immunolhistochemistry)、免疫細胞化學(xué)(immunolcytochemistry)等，可以參考如下步驟進行操作。1.樣品準備(Samp1epreparation)對于貼壁細胞：可
5、以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養(yǎng)細胞，然后到預(yù)定時間時進行固定等后續(xù)操作。也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的銀子放置到6孔板內(nèi)，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醉。這時就可以種入細胞進行培養(yǎng)，待細胞貼在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續(xù)操作。對于懸浮細胞：把細胞先在固定液小固定，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續(xù)操作。如果細胞的粘附能力不佳，可以在載玻片上川PDL等物質(zhì)進行處理，以增強載玻片的粘附能力。對于冷凍切片：FrozenS
6、ections切片放置在載玻片上后，可以百接進行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：paraffinsection脫蠟：切片在二甲苯屮脫蠟5分鐘，再換川新鮮的二甲苯脫蠟，共川二甲苯脫蠟3次。無水乙醉5分鐘，兩次。90%乙醉5分鐘，兩次，70%乙醉5分鐘，一次。蒸館水5分鐘，兩次?？乖迯?fù)：根據(jù)不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復(fù)液屮，10mM檸檬酸鈉,pH6.0,或ImMEDTA,pH&O,或10mMTris,pHlO.O,95°C加熱12分鐘，大約在30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。1.固定可以使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗?/p>
7、定細胞或切片，例如碧云天牛產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)0固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌兩次，每次5分鐘。2.封閉(Blocking)加入免疫染色封閉液(P0102),封閉60分鐘。如果背景較高，可以4°C封閉過夜。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。在整個免疫染色過程屮我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖床(ESIIK02)，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容易脫落，也可以把所有的步驟放置在桌血上靜止進行，即封閉、抗體孵育、洗
8、滌等步驟均不需搖動，但靜止操作時宜適當(dāng)延長作用時間或次數(shù)。3.—抗孵育(Primaryantibodyincubation)參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液(P0I03)稀釋一抗。川微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4°C在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一?抗孵育一小時效果不佳，可以4°
