免疫熒光染色步驟.doc

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1、免疫組織化學(xué)染色步驟1．將石蠟切片二甲苯脫蠟（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸餾水沖洗后，0.01MPBS沖洗，5min×3次；2．枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，加熱使水溫達(dá)92-96℃，維持10-15min，自然冷卻至室溫，0.01MPBS沖洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，0.01MPBS沖洗，5min×3次；4．正常羊血清封閉，37℃，30min；5．傾去多余血清，滴加一抗，37℃2小時或者4℃過夜，

2、0.01MPBS沖洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30min，0.01MPBS沖洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30min，0.01MPBS沖洗，5min×3次；8．DAB避光顯色，顯微鏡下控制顯色時間；9．0.01MPBS終止顯色；10．梯度酒精脫水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→無水酒精Ⅰ10min→無水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ10min；11．中性樹膠封片。免疫熒光染色步驟(1)將組織切片脫蠟入水；(2)抗原微波修復(fù)，溫度92℃-96℃，10-15min，自然冷

3、卻至室溫；(3)正常羊血清封閉，37℃，60min；(4)傾去多余血清，滴加一抗，37℃2小時或者4℃過夜，PBS沖洗，5min×3次；(5)滴加熒光素標(biāo)記的二抗，避光，37℃，60min，0.01MPBS沖洗，5min×3次；(6)防淬滅封片劑封片，4℃，避光保存。(7)熒光顯微鏡觀察拍照。細(xì)胞免疫組化染色（培養(yǎng)板中染色）1．培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，冷的PBS洗兩次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分鐘。2．在含0.1%TritonX-100（4孔板200μl）的PBS中進(jìn)行10min的透膜處理，PBS洗2次，每次5-10分鐘。手動輕輕晃

4、動數(shù)次，吸盡液體。3．羊血清用PBS配制成4％羊血清封閉液，室溫封閉（4孔板200μl）30分鐘。4．吸盡液體，勿洗，添加一抗，于37℃條件下孵育1h或放在4℃冰箱過夜，PBS洗3次，每次5-10分鐘。5．去除一抗后，細(xì)胞用PBS洗三次。6．加入二抗，然后加入相對應(yīng)的孔，在37℃下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分鐘。7．吸盡液體，加入三抗，在室溫條件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分鐘。同時采用不添加一抗，而僅添加二抗及三抗的細(xì)胞作為陰性對照組。8．DAB避光顯色，顯微鏡下控制顯色時間；9．PBS終止顯色；顯微鏡下觀察拍照。細(xì)胞免疫熒光染色（培養(yǎng)板中染

5、色）1．培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，冷的PBS洗兩次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分鐘。2．在含0.1%TritonX-100（4孔板200μl）的PBS中進(jìn)行10min的透膜處理，PBS洗2次，每次5-10分鐘。手動輕輕晃動數(shù)次，吸盡液體。3．羊血清用PBS配制成4％羊血清封閉液，室溫封閉（4孔板200μl）30分鐘。4．吸盡液體，勿洗，添加一抗，于37℃條件下孵育1h或放在4℃冰箱過夜，PBS洗3次，每次5-10分鐘。5．去除一抗后，細(xì)胞用PBS洗三次。6．滴加熒光素標(biāo)記的二抗，避光，37℃，60min，0.01MPBS沖洗，5min×

6、3次；7．防淬滅封片劑封片，4℃，避光保存。8．熒光顯微鏡觀察拍照。細(xì)胞爬片后的步驟同切片的免疫組織化學(xué)及免疫熒光的步驟。HE染色1.石蠟切片常規(guī)脫蠟入水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min→100%酒精Ⅰ、Ⅱ→95%酒精Ⅰ、Ⅱ→80%酒精→70%酒精→50%酒精各1-2min。2．水洗：普通水洗2次，蒸餾水洗1次。3.蘇木素染色10min。4.充分水洗：自來水洗10min。5.鹽酸酒精分色：分色10-30s，隨時鏡檢分色程度，使不該著色的部分全部褪去，應(yīng)著色的部分著色適當(dāng)。著色標(biāo)準(zhǔn)：胞核為深藍(lán)色，胞質(zhì)無色或淺灰色。6.充分水洗：自來水洗10min。7.氨水藍(lán)化2-3min。8.充分水洗：自來水洗

7、10-15min，水洗后若染色太淺則可重新返回蘇木素。9.脫水：70%、80%酒精各1-2min。10.伊紅染色0.5min左右，隨時鏡下觀察，染色不宜過深，要與蘇木素作對比，要協(xié)調(diào)鮮明。11．脫水透明：95%酒精Ⅰ、Ⅱ各1-2min→100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15min→二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min。12．中性樹膠封片。