組織切片免疫熒光染色的具體步驟.pdf

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1、組織切片免疫熒光染色的具體步驟1直接免疫熒光法的操作步驟標(biāo)本的處理：石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用0.01MPBST漂洗5min×3/次；?2%BSA或10%BSA37C濕盒內(nèi)封閉30min?抗體染色：C孵育30min；–在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體(1:8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37?0.0lmol/LPBS(pH7.4)漂洗5min×3/次，不時震蕩(洗去多余游離的熒光素標(biāo)記的抗體)。?緩沖甘油封片–分析純無熒光的甘油9份+pH9.2，0.2M碳酸鹽緩沖液

2、1份配制。?鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察。?優(yōu)點：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。?缺點：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體。直接免疫熒光法的注意事項?對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度；?一般稀釋度不應(yīng)超過1:20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。?染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化；–染色時間：從10min到數(shù)小時，一般30min；C的低溫，延長染色時間。C可加強(qiáng)染色效果，但

3、對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色溫度：多采用室溫(25C30min效果好的多。–低溫染色過夜較37?試驗時需設(shè)置下列對照：–自發(fā)熒光對照(空白對照)：標(biāo)本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。–陽性對照：用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。–特異性對照(抑制試驗)：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。?若標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。?一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過

4、3min，就有熒光減弱現(xiàn)象；?經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強(qiáng)度會逐漸下降。2間接法又稱為熒光抗-抗體法需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標(biāo)記)。一抗對標(biāo)本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標(biāo)記的二抗來說又起著抗原作用。–可用來檢測標(biāo)本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。間接免疫熒光法操作步驟?標(biāo)本的處理及非特異染色的封閉同直接法；?一抗染色：C過夜。C作用30min或4–加未標(biāo)記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用0.01MpH7.4的PBS稀釋)，37?0.01MP

5、BST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)；C濕盒避光作用30min。?加熒光標(biāo)記的二抗抗體，37?0.01MPBST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；?甘油緩沖液封片?鏡檢?優(yōu)點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標(biāo)記抗體，可應(yīng)用于多種一抗；?缺點：是參加反應(yīng)的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機(jī)會增多。間接免疫熒光法的注意事項?熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。?每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：–陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物–陰性

6、對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物–熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物?標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。?一抗和二抗應(yīng)始終保持在標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。