石蠟切片免疫熒光染色方法.doc

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1、對于石蠟切片：1、烤片：60℃60分鐘2、脫蠟：二甲苯中Ⅰ脫蠟15分鐘→二甲苯Ⅱ脫蠟15分鐘→無水乙醇Ⅰ5分鐘→無水乙醇Ⅱ5分鐘→90%乙醇Ⅰ5分鐘→90%乙醇Ⅱ5分鐘→70％乙醇5分鐘→蒸餾水5分鐘→蒸餾水5分鐘。3、抗原修復(fù)：高壓修復(fù)，事先燒開鍋中的水，修復(fù)盒中加入0.01mol/l檸檬酸鈉，pH6.0(檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g加入1000ml蒸餾水中)，上汽后加熱10分鐘，關(guān)火。修復(fù)盒取出，放入裝有自來水的瓷缸中緩慢冷卻至室溫。2.去除內(nèi)源性酶：玻片取出放入濕盒，加3%H2O22(2mlH2O22加入18

2、ml蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光)，室溫孵育10分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘。（也可不用去除內(nèi)源性酶）。3.封閉(Blocking)????加10%正常驢血清（原液100ul+900ulPBS,1ml夠用30張片子），室溫孵育封閉30分鐘。如果背景較高，可以4℃封閉過夜。不用洗，用濾紙吸干周邊水分。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。4.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)????參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液（10%山羊血清

3、PBS或1%BSA-PBS）稀釋一抗。???立即加入稀釋好的一抗，4℃過夜，第二天取出復(fù)溫45分鐘。PBS洗3次，每次5分鐘。5.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)??按照適當(dāng)比例用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標(biāo)記的二抗，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。???PBS洗滌3次。每次5分鐘。如果結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。6.蛋白檢測(Detectionofproteins)????對于免疫熒光染色，此時已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀

4、察。7.復(fù)染用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色，室溫10分鐘，PBS沖洗5分鐘×3次，封片（封片劑或分析純的甘油與0.5molpH9.5碳酸緩沖液1：1混合）顯微鏡觀察，染色后為藍(lán)色熒光。????多重?zé)晒馊旧嚎墒褂眉t色熒光、綠色熒光和藍(lán)色熒光進(jìn)行三重?zé)晒馊旧?。例如用免疫熒光染色試劑?抗小鼠Cy3(P0193)進(jìn)行紅色熒光染色，隨后可以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC(P0186)進(jìn)行綠色熒光染色，在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒(C0003)對細(xì)胞核進(jìn)行染色，染色后為藍(lán)色熒光。0.5molpH9.5

5、碳酸緩沖液配方：NaHCO33.7gNa2CO30.6g雙蒸水溶解至100ml，調(diào)節(jié)pH至9.5