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1、不同的抗原修復方法對腎活檢標本石蠟切片免疫熒光染色的影響譚文1賈曉敏21.長沙市第八醫(yī)院病理科，湖南長沙410000；2.湖南省人民醫(yī)院病理科，湖南長沙410000[摘要]目的探討了不同的抗原修復方法對腎活檢標本石蠟切片免疫熒光染色的影響。方法選取該院30例腎活檢標本作為研究對象，隨機分成對照組與研究組，對照組采用冰凍切片方法，研究組采用石蠟切片方法，其中分成應用無抗原修復組、胰酶抗原修復組、高壓加熱抗原修復組，均進行免疫熒光染色。分析和對比研究組與對照組標本的免疫熒光染色結(jié)果。結(jié)果研究組中的胰酶抗原修復組與對照組的免疫熒光染色結(jié)果基本相同（P＜0.05）；研究組中高壓加
2、熱抗原修復組的假陰性明顯高于對照組（P＜0.05），研究組中無抗原修復組的染色效果比對照組較差（P＜0.05）；兩組所觀察的有效腎小球數(shù)均≥3個，兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論冰凍切片的免疫熒光染色標本無腎小球的時候，可以采用胰酶抗原修復作為補救措施。.jyqk厚石蠟切片，和2μm厚的冰凍切片，冰凍切片為對照組，石蠟切片為研究組，并將研究組的標本隨機分為胰酶抗原修復組、無抗原修復組、高壓加熱抗原修復組，分析和對比兩組的免疫熒光染色結(jié)果，兩組患者的年齡、性別、病程、病史等一般資料，數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。1.2方法1.2.1儀器與試
3、劑準備儀器準備：1個濕盒、1個電高壓消毒鍋，和3個過酸立式染缸。所有標本均采用型號為Nikon，80i的熒光顯微鏡進行觀察。試劑為：由丹麥DAKO公司生產(chǎn)的異硫氰熒光素標記的免抗人IgA、IgG、IgM、C1g、C3、Fib，和福州邁新生物技術公司生產(chǎn)的胰酶，以及采用自配制的枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液，3%過氧化氫溶液、PBS液。1.2.2修復方法先將所有標本進行常規(guī)處理。將玻片進行特殊處理后浸泡在多聚賴氨酸中，取出干燥備用。然后進行連續(xù)切片2μm，裱于載玻片上，將其置于60℃上進行烤片，5h后取脫蠟水對標本進行清洗，采用PBS緩沖液反復清洗數(shù)次，取3%過氧化氫溶液將標本的過
4、氧化物酶進行去除，處理時間一般為10min。最后，按照研究組的3種抗原修復方法分別進行免疫熒光染色。①無抗原修復組。標本進行常規(guī)處理后，放置待用。②胰酶抗原修復組。將常規(guī)處理后的標本在37℃的恒溫箱子里采用0.25%的胰酶進行孵育，當15min以后再用蒸餾水對標本進行反復沖洗兩次，將標本上的胰酶沖洗干凈。③高壓加熱抗原修復組。將枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液倒入過酸立式染缸中，再將立式染缸放進電高壓消毒鍋中，蓋上鍋蓋，打開壓力閥，將過酸立式染缸中的枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液煮沸，然后打開鍋蓋，將常規(guī)處理好的標本放入枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液中，將電高壓消毒鍋進行密封，并蓋上鍋蓋和關緊壓力
5、閥，再次進行加熱，直到電高壓消毒鍋開始噴氣，并噴氣兩分鐘后，將電高壓消毒鍋的電源關閉，打開壓力閥和鍋蓋，然后將鍋內(nèi)的過酸立式染缸取出，于常溫下放置20min，冷卻待用。研究組所有標本均進行不同的修復方法處理后，用蒸餾水反復沖洗兩次，再用PBS緩沖液清洗兩次，每次清洗時間為3min，清洗完成后將標本擦干，與冰凍切片一起放入準備好的濕盒內(nèi)，取相應的抗體10μL分別滴入標本上，在保持37℃的恒溫下進行孵育，1h后，再次取PBS對標本進行清洗2次，最后取甘油進行封片處理。用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。1.3觀察指標觀察和比較兩組的有效腎小球數(shù)和熒光抗體IgG、IgA、IgM、C1q、
6、C3的沉積位置。根據(jù)熒光抗體的沉積位置和熒光強度進行評定標本的陽陰性，陰性（-）：采用低倍鏡無法看見熒光，采用高倍鏡似可見熒光；弱陽性（+）：采用低倍鏡似可見熒光，采用高倍鏡可見熒光；陽性（++）：采用低倍鏡可以明顯的看見熒光，采用高倍鏡熒光非常清晰；較強陽性（+++）：在低倍鏡下熒光非常清晰，在高倍鏡下熒光表現(xiàn)為耀眼；強陽性（++++）：在低倍鏡下熒光表現(xiàn)為耀眼，在高倍鏡下熒光表現(xiàn)為刺眼。1.4統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行分析和處理，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。2結(jié)果2.1兩組有效腎小球數(shù)比較兩組標本所觀察到的有效腎小球數(shù)均≥3個，
7、兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。2.23種抗原修復法與對照組免疫熒光染色比較研究組中的胰酶抗原修復組與對照組的免疫熒光染色結(jié)果基本相同（P＜0.05）；研究組中高壓加熱抗原修復組的假陰性明顯高于對照組（P＜0.05），研究組中無抗原修復組的染色效果比對照組較差（P＜0.05）。見表2。3討論在腎疾病的診斷過程中，腎活檢組織免疫的檢查起到診斷標志性的作用，在腎活檢組織免疫的檢查中，主要分為冰凍切片免疫熒光染色檢查和石蠟切片免疫熒光染色檢查。但是在傳統(tǒng)的驗證中，由于福爾馬林固定會使標本的蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)的現(xiàn)象，抗原
