資源描述：
《冰凍切片的免疫熒光.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、免疫熒光通用操作規(guī)程冰凍切片的免疫熒光1，動(dòng)物組織直接OCT包埋，或灌流后的組織30%蔗糖溶液4℃過(guò)夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃長(zhǎng)期保存。請(qǐng)勿保存于液氮。2，冰凍切片機(jī)切片至少10um，空氣干燥2分鐘后，-20℃儲(chǔ)存3，切片從-20取出后，在通風(fēng)櫥放10-30分鐘以去除水汽，4%PFA固定15分鐘，或-20℃丙酮固定15分鐘置通風(fēng)櫥2小時(shí)4,1XPBS清洗玻片，3X5min從此請(qǐng)保持玻片濕潤(rùn)5，有時(shí)，抗原修復(fù)3小時(shí)會(huì)得到更好的結(jié)果。為此請(qǐng)：選用穩(wěn)定的抗原修復(fù)方式（真空負(fù)壓.微波修復(fù).高壓修復(fù).隔水加熱.電爐加熱）…關(guān)注修復(fù)的溫度，時(shí)間（抗原修復(fù)時(shí)
2、在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間），抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，使用足量的抗原修復(fù)液…選擇不同PH值的修復(fù)液（A液枸鹽酸緩沖液PH6.0，B液EDTA-Na緩沖液PH8.0，C液枸鹽酸緩沖液PH4.5）6，室溫封閉1小時(shí)封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS（細(xì)胞因子，無(wú)需封閉的蛋白7，一抗4℃過(guò)夜請(qǐng)用封閉液稀釋一抗8,第二天Wash,1XPBS,2x1min9,二抗，1:1000（alexa系列）1:300（dyelight)in封閉液，避光室溫1小時(shí)10,Wash,1X
3、PBS,3x5min11,DAPI染核5min，12，DDWRinse13，抗淬滅劑封片，（避免氣泡）避光置于通風(fēng)櫥過(guò)夜14，干片后4℃保存石蠟切片的免疫熒光1，動(dòng)物組織取出后經(jīng)固定-脫水-包埋（見(jiàn)隨后操作步驟)，制成石蠟包塊2，組織學(xué)染色切片厚度2um，免疫熒光染色切片厚度至少6um，切片復(fù)水：58℃20min-xylene2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-，DDW5min4,Rinse玻片1xPBS,從此請(qǐng)保持玻片濕潤(rùn)5，抗原修復(fù)過(guò)夜。為此請(qǐng)：選用穩(wěn)定的抗原修復(fù)方式（真空負(fù)壓.微波修復(fù).高壓
4、修復(fù).隔水加熱.電爐加熱）…關(guān)注修復(fù)的溫度，時(shí)間（抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間），抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，使用足量的抗原修復(fù)液…選擇不同PH值的修復(fù)液（A液枸鹽酸緩沖液PH6.0，B液EDTA-Na緩沖液PH8.0，C液枸鹽酸緩沖液PH4.5）6，室溫封閉1小時(shí)封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS（細(xì)胞因子，無(wú)需封閉的蛋白7，一抗4℃過(guò)夜請(qǐng)用封閉液稀釋一抗，如果沒(méi)有二抗種屬來(lái)源的正常血清，細(xì)胞因子用1%BSA封閉，同時(shí)一定要有一個(gè)陰性對(duì)照。8,第二天Wa
5、sh,1XPBS,2x1min9,二抗，1:1000（alexa系列）1:300（Dyelight)in封閉液，避光室溫1小時(shí)10,Wash,1XPBS,3x5min11,DDWRinse,DAPI染核5min，12，DDWRinse13，抗淬滅劑封片，（避免氣泡）避光置于通風(fēng)櫥過(guò)夜14，干片后4℃保存?zhèn)渥ⅲ憾嘀責(zé)晒馊旧瓌tA:盡量選擇不同種屬來(lái)源的一抗：可同時(shí)染B:如果種屬來(lái)源相同的一抗：可順次染色，抗原修復(fù):O/N第一個(gè)一抗：4℃O/N,第二天對(duì)應(yīng)二抗@RT1hr紅光短暫地封閉第二個(gè)一抗：@RT2hr，對(duì)應(yīng)二抗@RT1hr綠光：DAPI封片備注：對(duì)照實(shí)驗(yàn)A:
6、陰性對(duì)照：組織免疫熒光必做相同標(biāo)本：只加熒光二抗:排除非特異性染色不同樣本：采用確定不含一抗對(duì)應(yīng)抗原的標(biāo)本驗(yàn)證熒光信號(hào)的特異性B：陽(yáng)性對(duì)照：采用確定含有一抗對(duì)應(yīng)抗原的標(biāo)本TUNEL與免疫熒光共染時(shí)細(xì)胞的免疫熒光1，細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁到80%融合，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液2，Rinse，用固定劑rinse一到兩次3，首選4%多聚甲醛固定15min，0.2%TritonX-100打孔5-10min；或者選用不同的固定方式：甲醇（分析純orHPLC)-20℃10min丙酮（HPLC）-20℃10min4%多聚甲醛+0.2%TritonX-10010min4%多聚甲醛+0.2%Sapo
7、nins10min細(xì)胞核核膜4%多聚甲醛15min+-20℃甲醇5min細(xì)胞膜4%多聚甲醛15min+-20℃丙酮5min細(xì)胞骨架/微管蛋白4%多聚甲醛10min@RT+4℃10min+-20℃甲醇1min細(xì)胞膜+胞漿蛋白+細(xì)胞核4,Wash,1xPBS,2x1min從此請(qǐng)保持細(xì)胞濕潤(rùn)5,室溫封閉1小時(shí)封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS條件封閉液：1%BSA+3%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS6，一抗4℃過(guò)夜請(qǐng)用封閉液稀釋一抗7,第二天Wash,1XPBS,2x1min8,二抗，1:1000（alexa系列）1:300（Dyel
8、ight)in封閉液，避
