冰凍切片免疫熒光取材.docx

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1、2.1.5免疫熒光技術(shù)檢測PTEN蛋白表達(dá)。2.1.5.1標(biāo)本制備1)取材：對照組和模型組分別隨機選取15只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d時相點進(jìn)行免疫熒光技術(shù)檢測，每個時相點3只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100克，腹腔注射)，先用生理鹽水灌注（生理鹽水的量不能少于250ml，最好300ml以上），將血液沖凈后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol磷酸緩沖液配制的4°C4%多聚甲醛（PH=7.4）約250ml灌注至肢體僵硬，待充分固定后斷頭取腦組織，組織厚度約為3~5mm。灌注一定要充分，肝臟變硬呈瓷白色為

2、最佳；2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。3)灌流固定好的腦組織不需后固定可直接脫水；脫水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脫水10~24h，換新液繼續(xù)脫水，組織沉底后即可包埋；4)包埋：包埋器（本實驗采用奶片盒或大片劑含片盒替代包埋器）內(nèi)先放入少量OCT，將組織塊放入（放組織時動作要慢，輕輕下壓，小心組織移位和產(chǎn)生氣泡），放好后繼續(xù)加入OCT至全部包裹組織為止，將標(biāo)注的紙條放于包埋塊周邊，以明確分組及定位大腦的前后切面位置。將包埋好的組織塊直接放入-80℃冰箱冷凍，凍好后用錫紙包好-80℃保存?zhèn)溆茫?)切片：切片

3、前先將恒冷箱切片機調(diào)至-20℃預(yù)冷20min，同時將組織從-80℃冰箱內(nèi)取出，置于恒冷箱切片機內(nèi)30min，將組織塊用OCT粘貼在托物臺固定，冠狀面連續(xù)切片，然后進(jìn)行切片。6)貼片染色標(biāo)本切片厚度為15~20um，漂片染色（蛋白表達(dá)量低的采用）切片厚度為30~40um。選用多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片進(jìn)行貼片，貼片時玻片應(yīng)從一側(cè)貼附切片，如果不平可用小毛筆蘸少許純水輕輕撫平。7)將貼好的切片置于37℃溫箱烤1h，烤干后即可進(jìn)行染色或裝入切片盒密封-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.5.2免疫熒光染色步驟1)取出冰凍切片，室溫放置30m

4、in，PBS洗10min×3次；2)0.4%Triton-100浸泡10min（1000mlPBS+4mlTriton-100）；3)PBS洗10min×3次；4)抗原修復(fù)（高壓鍋限壓閥冒氣后計時1.5min，冷水降壓，自然冷卻）；5)PBS洗10min×3次；用組化筆在距離組織2mm處劃圈；6)5%驢血清（與二抗源性相同）封閉1h；7)一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃過夜。陰性對照用PBS替代一抗；8)PBS洗10min×3次；9)二抗：滴加AlexaFluor488標(biāo)記的驢抗羊熒光二抗（均為1：2

5、00配置），20~25℃室溫避光孵育2h；10)PBS洗10min×3次；11)Hochest33342復(fù)染核10~20min；12)PBS洗10min×3次；13)抗熒光衰減封片劑封片，置于避光盒內(nèi)；14)OlympusF1000激光共聚焦顯微鏡用488nm波長的激光器激發(fā)綠色，計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和成像。