順鉑作用于耐順鉑卵巢上皮癌細胞后其細胞生物學特性的改變.pdf

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1、廣西醫(yī)科大學學報2013Feb：30(1)JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY7·33·順鉑作用于耐順鉑卵巢上皮癌細胞后其細胞生物學特性的改變石麗君于紅靜李力王琪△(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院南寧530021)摘要目的：探討耐順鉑卵巢癌SKOV3／DDPⅡ細胞對于順鉑作用后其細胞周期、凋亡、增殖及鉑類耐藥相關基因ARHGDIB和CCND1表達量的變化。方法：采用流式細胞術檢測不同濃度和時間順鉑作用后SKOV3／DDPII細胞周期和凋亡率的變化，并與標記GFP的上皮性卵巢癌細胞株SKOV

2、3一GFP(敏感株)相比較；通過3-(4，5一二甲基噻唑一2)一2，5一二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測不同濃度和時間順鉑作用后細胞增殖的變化；實時熒光定量PCR(QRT—PCR)檢測裸鼠體內(nèi)瘤塊耐藥基因CC—ND1和ARHGDIB基因的表達情況。結(jié)果：半抑制濃度的順鉑作用48h后，SKOV3一GFP和SKOV3／DDP1I兩株細胞分布于G。／G期的比例相對于無順鉑處理組明顯下降(P

3、8h內(nèi)SKOV3一GFP和SKOV3／DDPII兩株細胞凋亡率隨時間和濃度的增大而增大；以9．9，19．8，29．7“mol／L濃度的順鉑處理6d以后，SKOV3／DDP1I的增殖抑制得到解除，并繼續(xù)生長，而SKOV3一GFP細胞則隨順鉑作用時間延長增殖持續(xù)受到抑制。順鉑作用體內(nèi)移植瘤5次后，CCND1在SKOV3／DDP1I一5的相對表達比sK0V3／DDPII一0增高92．98倍，作用第8次后，ARHGDIB在SKOV3／DDPⅡ一8的相對表達比SKOV3／DDPⅡ一0增高2．51倍。結(jié)論：具有耐藥表型的卵巢

4、上皮癌細胞在順鉑作用下降低分布于G。／G期細胞數(shù)使細胞生長受到一定程度的抑制，但在順鉑刺激后腫瘤細胞過度表達CCND1基因使細胞J~il通過G／s檢查點促進腫瘤細胞增殖，同時上調(diào)表達ARHGDIB基因抵抗順鉑誘導的腫瘤細胞凋亡。關鍵詞耐順鉑卵巢癌；順鉑；周期分布；增殖；凋亡中圖分類號：R737．31文獻標志碼：A文章編號：1005—930X(2013)01—0033—05順鉑是卵巢癌一線的化療藥。對順鉑產(chǎn)生耐藥性是影1．4細胞凋亡率測定：將SKOV3一GFP和SKOV3／DDPⅡ響卵巢癌以順鉑為主的聯(lián)合化療方案治

5、療效果的一個重要細胞以每孔2x10個接種于6孔培養(yǎng)板。以濃度分別為原因。耐藥的卵巢癌細胞是如何抵抗順鉑誘導的細胞凋9．9，19．8，29．7mol／L和39．6mol／L的順鉑處理各細胞，亡，其機制到目前為止還未完全清楚。因此，我們選用裸鼠于12，z4，36h和48h時收集細胞，上流式儀檢測細胞的凋體內(nèi)誘導的SK0V3／DDPⅡ耐藥細胞株為模型，初步探討卵亡率，方法按凋亡試劑盒(BDPharmingenAnnexinV：PE巢癌耐藥細胞對順鉑作用的抵抗機制，為耐藥逆轉(zhuǎn)研究奠定ApoptosisDetectionK

6、itI)說明書進行，每處理3次重復。理論基礎。1．5細胞增值檢測：將SKOV3一GFP和sK0V3／DDPⅡ細胞以每孔1000個接種于96孔培養(yǎng)板。以濃度分別為9．9，1材料和方法19．8，29．7mol／L和39．6~mol／L的順鉑處理各細胞，對照組為DulcetMeaglemedia(DMEM)培養(yǎng)液，DDP作用24hI．1材料：sKOV3一GFP和sK0V3／DDPⅡ細胞株由本實驗后換為普通DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。DDP作用24h后(即室自建，順鉑為山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，3-(4，5-二甲基順鉑作用后

7、第1天)，每孑L加入5g／L的MTT20L，繼續(xù)培噻唑一2)-2，5-Z．苯基四氮唑溴鹽(MTT)由濟南翔科生物技術養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加入100“L二甲基亞砜溶解，用酶標有限公司生產(chǎn)，細胞周期試劑盒(CycletestPlusDNARea—儀檢測波長為540nm各孑L光密度值，以后每天檢測1次，直gentKit)和凋亡試劑盒(AnnexinV：PEApoptosisDetection至加藥后第9天。細胞的增殖率／抑制率一(當天所測吸光KitI)和Influx流式細胞儀均為美國BD產(chǎn)品。sYBR度一同一細胞前一

8、天所測得吸光度)／同一細胞前一天所測PremixExTaqII購自TAKARA公司，M—MLVReverse得吸光度×100％。Transcriptase由Promega公司提供。1．6QRT—PCR檢測鉑類耐藥相關基因的表達：SKOV3一1．2實驗動物：裸鼠(SPFBalB／C)由廣西醫(yī)科大學動物實GFP和sKOV3／DDPII細胞接種于裸鼠腹股溝皮下成瘤后，驗中心提供