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《HCMV重組嵌合抗原表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫反應(yīng)的初步鑒定-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、·752·安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Jun；49(6)HCMV重組嵌合抗原表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫反應(yīng)的初步鑒定曾憲聰，汪小五，陳偉，王林定摘要目的選用人巨細(xì)胞病毒(HCMV)抗原性強(qiáng)且親水1材料與方法性較高片段構(gòu)建融合抗原表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其表達(dá)，純化目的蛋白；并初步鑒定其免疫反應(yīng)性。方法通過(guò)Protean軟件1．1材料來(lái)源pQE．80L、菌株BI21(DE3)由本實(shí)分析了HCMVUL32、UIA4、UL83序列，設(shè)計(jì)合理引物；各基驗(yàn)室保存。因片段用Overlap方法連接，并引入BgllI、BamHI酶切位1．2主要試劑PstI、B
2、gl1、BamHI、SalI購(gòu)自點(diǎn)，使之可通過(guò)酶切與質(zhì)粒pQE一80L連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入日本TaKaRa公司；PVDF膜購(gòu)自上海生物工程有限感受態(tài)BL21(DE3)菌株，經(jīng)PCR、酶切鑒定目的基因后再誘公司；Nin．NTA親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE公司；50導(dǎo)、表達(dá)、純化，獲得目的蛋白，采用Westernblot法檢測(cè)免疫ml親和層析預(yù)裝柱購(gòu)自上海生物工程有限公司；反應(yīng)性。結(jié)果誘導(dǎo)后的重組菌pQE80一L—UL32一UIA4一UL83HRP標(biāo)記山羊抗人IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技經(jīng)十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)證術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自瑞士Thermo實(shí)
3、蛋白表達(dá)在包涵體。純化后獲得大小約為52ku的目的公司。蛋白，采用Westernblot法檢測(cè)證實(shí)重組嵌合抗原能與HC—1．3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建MV陽(yáng)性血清有反應(yīng)。結(jié)論構(gòu)建了重組嵌合抗原表達(dá)質(zhì)1．3．1HCMV抗原片段引物設(shè)計(jì)利用Protean軟粒，并誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得目的蛋白。Westernblot法鑒定件分析了UL32_5-6]、uL44[、UL83Is-9]、氨基酸序嵌合抗原是HCMV特異性抗原且有免疫反應(yīng)性。列，抗原性強(qiáng)且親水性好的片段。分析了UL32、關(guān)鍵詞人巨細(xì)胞病毒；重組融合抗原；免疫反應(yīng)性u(píng)L44、UL83氨基酸序列。選擇UL32A(372aa～中圖分類號(hào)R373．4文
4、獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號(hào)1000—1492(2014)06—0752—05442aa，213bp)UL32B(522aa～552aa，93bp)、UL32C(705aa～727aa，69bp)；UIA4選擇2個(gè)片段，人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)分別為UIA4A(1aa～40aa，120bp、)UI44B(403aa又稱為人皰疹病毒5型，屬B一皰疹病毒亞科，HCMV～421aa，57bp)；UL83選擇3個(gè)片段，分別為感染極為普遍，在育齡期婦女中感染率可達(dá)95％以UL83A(169aa～271aa，309bp)、UL83B(361aa～上¨J。此外，HCMV
5、感染可通過(guò)胎盤侵襲胎兒引478aa，354bp)、UL83C(535aa～561aa，81bp)。選起先天性感染，少數(shù)造成早產(chǎn)、死產(chǎn)或生后死亡J。取在蛋白質(zhì)N端和c端之間的區(qū)域，Jameson．wolf母嬰感染HCMV的快速診斷對(duì)于決定是否保留胎抗原決定簇選正分高處；Kyte．Doolittle預(yù)測(cè)親水性強(qiáng)的區(qū)域。最后將選擇好的氨基酸序列連成一條完兒，及采取何種干預(yù)措施非常重要。目前國(guó)內(nèi)外已整序列，預(yù)測(cè)重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的可溶性。有多家實(shí)驗(yàn)室及試劑生產(chǎn)廠家研制生產(chǎn)HCMVIgM預(yù)測(cè)網(wǎng)址：http：／／biotech．OH．edu／。然后根據(jù)選定抗體檢測(cè)試劑盒，由于缺乏靈敏度強(qiáng)和特異
6、性高的基因段序列，設(shè)計(jì)合理引物。各基因的片段用Over．抗原以及生產(chǎn)條件和標(biāo)準(zhǔn)各異，因此該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一1apPCR方法連接，引入PstI、Bgl1I、BamHI酶切步研究HCMV相關(guān)基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室診斷與應(yīng)用提供位點(diǎn)，OverlapPCR引物設(shè)計(jì)，在引物A2的3端加支持，提高我國(guó)孕婦早期HCMV感染的檢出率。入了B基因5端的序列，在引物B1的5端加人了2014一O1—15接收20個(gè)A基因3端序列。由于需要構(gòu)建到pQE一80L基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81271837)；安徽省教育廳自然的質(zhì)粒中，故在每個(gè)融合基因的兩端加入酶切位點(diǎn)，科學(xué)基金(編號(hào)：KJ2012A161)；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科
7、研在引物B2的3端加入BamHI的酶切位點(diǎn)，引物經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(編號(hào)：XJ200914)A1的5端加入BglⅡ與SalI酶切位點(diǎn)，便于引入新作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室、病原與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，的基因片段。見(jiàn)表1。合肥230032作者簡(jiǎn)介：曾憲聰，女，碩士研究生；1．3．2含目的基因的克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建王林定，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E．mail：Wal1．PCR產(chǎn)物膠回收，按DNA回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操glindin
