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《HSP-FLP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)分析-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第33卷第5期懷化學(xué)院學(xué)報(bào)Vo1．33．No．52014年5月JOURNALOFHUAIHUAUNIVERSITYMaY．2014HSP—FLP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)分析屈永貴，陳婷芳，王靜，王飛英，吳秀山，鄧云(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙410081)摘要：為了制備用于在斑馬魚中熱休克全身表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因載體，通過分子克隆的方法從P{hsFLP}86E／TM6B轉(zhuǎn)基因果蠅的基因組中克隆出FLP．并同時(shí)對(duì)HSP—Wnt5A—EGFP栽體進(jìn)行改造，Wnt5A由FLP代替，并在FLP和EGFP編碼區(qū)之問插入帶有多克隆位點(diǎn)的IRES序列，獲得pTol2一HSP—FLP—IR
2、ES—EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體．利用得到的轉(zhuǎn)基因載體顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明，經(jīng)熱激外源目的基因FLP和報(bào)告基因EGFP均能在斑馬魚中表達(dá)．pTo12一HSP—FIJP—IRES—EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建對(duì)于建立FIJP，F(xiàn)RT重組系統(tǒng)的斑馬魚轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ途哂兄匾饬x．關(guān)鍵詞：HSP；FLP；斑馬魚；轉(zhuǎn)基因中圖分類號(hào)：Q341文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1671—9743(2014)5—0033—04斑馬魚具有繁殖能力強(qiáng)，體外受精和發(fā)育，性成魚．通過FLP／FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬熟周期短，個(gè)體小易養(yǎng)殖，后代繁育數(shù)量大，光透性魚品系
3、，讓研究者們能夠像在小鼠和植物中那樣設(shè)計(jì)的胚胎，可針對(duì)治療藥物進(jìn)行高通量篩選等諸多特點(diǎn)，一些更加簡潔地斑馬魚條件敲除實(shí)驗(yàn)．使其成為后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究中重要的模式脊1材料與方法椎動(dòng)物之一[．隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷地發(fā)展，基因完全敲除、1．1材料基因條件敲除、基因插入、點(diǎn)突變、缺失突變、染色pTol2一Cmlc2一ires—EGFP、HSP—Wnt5A—GFP質(zhì)體組大片段刪除等基因工程技術(shù)也隨之而生．像位點(diǎn)粒以及大腸桿菌DH5a菌株為湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研特異重組屬于一種基因條件敲除，位點(diǎn)特異重組是由究中心一80~C保存．質(zhì)粒小提試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒位點(diǎn)特異重組酶介導(dǎo)的DNA
4、重組反應(yīng)，Cre／loxp和小提試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，pMD18FLP／FRT系統(tǒng)是研究最為詳細(xì)的兩個(gè)重組酶系統(tǒng)，并一T載體、DNA連接試劑盒、ExTaqDNA聚合酶購自且越來越廣泛的應(yīng)用于基因的調(diào)控和條件敲除_2J．這TaKaRa公司，各種限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司，兩個(gè)系統(tǒng)具備無啟動(dòng)子限制、無明顯底物偏好、基因大腸桿菌OneShotecdBSurvivalCompetentCells購自調(diào)控效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)l3J．FLP／FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)Invitrogen公司，一80℃保存．斑馬魚獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)由于具有比Cre／loxp系統(tǒng)更高的重組效率
5、和靶向性，已(北京愛生)、顯微注射儀(HARVARDAPPARATUS)．經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、HIV病毒等微生物和擬南芥、1．2方法水稻、小鼠、大鼠、果蠅、線蟲等高等真核模式生物1．2．1pTol2一HSP—FLP—ires—EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建的研究中，實(shí)現(xiàn)了基因條件敲除、基因插入、點(diǎn)突變、首先挑50個(gè)P{hsFLP}86E／TM6B轉(zhuǎn)基因果蠅胚缺失突變、染色體組大片段刪除等基因工程操作4J．胎，提取基因組．以其為模板，以FLP—F(5’一3’)：G然而，在模式生物斑馬魚中幾乎沒有看到FLP／FRT位GGCCTGCAGGACCATGCCACAATTTGA點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的報(bào)
6、道．為了相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)從TATATTATGT和FLP—R(5’一3’)：GCCCGGGFLP／FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因品系的果AGATCTTTAAATGCGTACTTATATGCG蠅基因組中克隆出FLP序列，構(gòu)建了FLP的真核表達(dá)TcTATT為引物，利用EXTaqPCR擴(kuò)增FLP序列并載體pTol2一HSP—FLP—EGFP，pTol2一HSP—FLP—純化回收1300bp的片段．隨后將其連接入pMD18一TEGFP可以表達(dá)FLP重組酶，并構(gòu)建了其轉(zhuǎn)基因斑馬載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，酶切、測序鑒定獲得正確收稿日期：2014一O1—19基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)
7、目“人類心臟和肌肉高水平表達(dá)基因POP1在心肌肥大中的作用研究”(81170088)；湖南省研究生創(chuàng)新性課題“利用斑馬魚模型研究Trim45基因在血祖細(xì)胞形成與分化中的作用”(CX2012B212)．作者簡介：屈永貴，1986年生，男，湖南瀏陽人，碩士生，研究方向：分子發(fā)育遺傳學(xué)；*通訊作者：鄧云，1969年生，男，湖南洞口人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心臟發(fā)育基因調(diào)控機(jī)理．·36·懷化學(xué)院學(xué)報(bào)2014年5月慢地開始傾向選擇TALEN敲除技術(shù)，使之代替Cre／loxp魚心臟組織特異
