nox4報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控初探論文

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1、NOX4報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控初探論文趙麗君劉燕翔劉珍王伯瑤黃寧吳琦【摘要】目的：構(gòu)建NOX4熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體，探討NOX4基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。方法：以細(xì)胞基因組DNA為模板作，采用PCR擴(kuò)增NOX4基因上游調(diào)控序列(533bp)，插入質(zhì)粒pGL3basic載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3NOX4，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定。將pGL3NOX4轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過細(xì)胞因子刺激觀察報(bào)告基因表達(dá)水平。結(jié)果：酶切及測序證實(shí)NOX4報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的A549細(xì)胞以細(xì)胞因子刺激，結(jié)果顯示NOX4表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論：成

2、功構(gòu)建了NOX4熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體.freel為Promega產(chǎn)品。質(zhì)粒提取，PCR產(chǎn)物純化及凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。DMEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。新生小牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，細(xì)胞因子TNFα、IFNγ購自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP,限制性內(nèi)切酶(Xho1，BamHⅠ)，T4DNA連接酶等購自Takara公司。基因組DNA提取試劑盒，DL2000DNAMarker購自天根生物技術(shù)有限公司。2方法2.1質(zhì)粒載體的構(gòu)建2.1.1引物合

3、成通過GenBank檢索NOX4基因全序列，參考相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出含有NFκB結(jié)合位點(diǎn)的NOX4基因上游調(diào)控序列。引物設(shè)計(jì)采用Primer5.0軟件，其序列如下：P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAGP2：GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA引物分別含限制性內(nèi)切酶Xho1，BamHⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段全長533bp。引物由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。2.1.2PCR以細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μL，含10×PCR反應(yīng)buffer2.5μL;dN

4、TP2μL;上下游引物各0.5μL;Pfu高保真酶0.2μL;DNA模板0.5μL;其余加水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為94℃變性3min，之后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94℃30s，.51℃30s，72℃4min,，)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產(chǎn)物做電泳膠回收。pGL3basic載體用Xho1，BamHⅠ雙酶切，小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收質(zhì)粒載體。2.1.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)酶切純化后的PCR產(chǎn)物和pGL3basic載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌

5、中，涂布于LB培養(yǎng)板，37℃孵育過夜，挑取細(xì)菌克隆提質(zhì)粒，用Xho1，BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，最后經(jīng)ABI3730全自動(dòng)DNA測序儀進(jìn)行測序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因活性檢測2.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染用含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞。將對數(shù)生長期的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，按每孔10×104個(gè)細(xì)胞密度接種于48孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)85-95%時(shí)，按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行重組質(zhì)粒pGL3basicNOX4和pRLTK載體轉(zhuǎn)染。具體操作為將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無血清的DMEM(10

6、0μL/孔)，Lipofectamine2000與質(zhì)粒DNA(報(bào)告基因重組質(zhì)粒和內(nèi)對照質(zhì)粒pRLTK)以一定比例各加入100μL無血清的DMEM中，5min后混合，室溫孵育20min，再加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，37℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24-48h。2.2.2細(xì)胞因子刺激試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組為TNFα組，IFNγ組，TNFα+IFNγ組，空白對照組。TNFα終濃度為25ng·mL-1，IFNγ終濃度為10ng·mL-1，在細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)(6h，12h，24h)，裂解細(xì)胞檢測NOX4報(bào)告基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3復(fù)孔

7、。2.2.3報(bào)告基因活性檢測在細(xì)胞因子刺激細(xì)胞后的不時(shí)間點(diǎn)吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞。每孔加入60μL的1×PLB細(xì)胞裂解液(按DualLuciferaseReportAssaySystem試劑盒說明配備)，孵育30min，收集裂解液，10000轉(zhuǎn)4℃離心10min，上請儲存于-20℃?zhèn)溆谩Ｈ?0μL細(xì)胞裂解上請，根據(jù)DualLuciferaseReportAssaySystem試劑盒說明進(jìn)行報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶及內(nèi)對照海腎熒光素酶檢測，儀器采用BeckmanCoulterDTX880。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析，采用T檢驗(yàn)

8、。3結(jié)果3.1報(bào)告基因重組質(zhì)粒(pGL3NOX4)的構(gòu)建和鑒定以基因組DNA為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果在約533bp處可以見到與預(yù)期大小相符的目的片段(圖1)。P