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《鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)作者：胡權(quán)，張正茂，張小勇，張振華，雷延昌，周敦金，黃建國，楊東亮【摘要】目的構(gòu)建鴨乙型肝炎病毒感染性克隆，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得單一來源、基因序列清楚的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的感染毒種。方法以湖北麻鴨DHBV分離株為模板，用PCR法從該DHBV全基因組克隆質(zhì)粒和DHBV陽性血清中獲取3部分基因片段，總長44kb，克隆至載體PCR21的Sacl和NotI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建含15倍鴨乙型肝炎病毒全基因的重組質(zhì)粒，并酶切鑒定其插入方向。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體LipofectineTM2000導(dǎo)入雞肝癌細(xì)胞系(LMH)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染
2、表迗，收集純化后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染的標(biāo)準(zhǔn)毒種。結(jié)果PCR鑒定、酶切鑒定及序列測定，證實(shí)成功獲得正向插入的倍鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒。Southernblot檢測表明，該重組質(zhì)粒在LMH細(xì)胞內(nèi)存在各種病毒復(fù)制中間體；通過電鏡觀察，轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中存在DHBV完整病毒顆粒。結(jié)論經(jīng)體外重組，構(gòu)建出攜帶倍加長DHBV基因組片段的重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15,并可在雞肝癌細(xì)胞LMH中介導(dǎo)高水平病毒復(fù)制，從而獲得含可自我復(fù)制病毒顆粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液作為動物體內(nèi)感染接種物?！娟P(guān)鍵詞】鴨乙型肝炎病毒鴨乙型肝炎病毒與人類乙型肝炎病毒同
3、屬嗜肝DNA病毒科，它們在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因序列、病毒復(fù)制、致病機(jī)制及感染宿主規(guī)律等方面均較為相似，DHBV感染鴨模型使人們認(rèn)識了嗜肝病毒的復(fù)制周期以及病毒持續(xù)存在和病毒徹底清除的機(jī)制。我們在對湖北麻鴨DHBV自然感染率調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇對DHBV易感且取材方便的湖北麻鴨作為實(shí)驗(yàn)鴨種，并分離出1株DHBV新毒株（1）。進(jìn)而以該毒株為模板，構(gòu)建了15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒，通過該質(zhì)粒在雞肝癌細(xì)胞系（LMH）中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)出含有可自我復(fù)制的病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為單一來源、基因序列清楚的實(shí)驗(yàn)毒種，以期建立標(biāo)準(zhǔn)化的湖北麻鴨乙型肝炎病毒體內(nèi)模型。另
4、外，將該DHBV重組質(zhì)粒與不同劑量人類載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽3G（APOBEC3G）真核表迗質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞，通過抑制實(shí)驗(yàn)以證實(shí)該DHBV體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某醪綉?yīng)用。1材料與方法11材料111質(zhì)粒pMD-DHBV為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有湖北麻鴨DHBVDNA全長基因組的質(zhì)粒；pSP65-DHBV16為雙拷貝頭尾相接的全基因DHBVDNA重組質(zhì)粒，該克隆質(zhì)粒（美國Mandart教授饋贈）；APOBEC3G真核表迗質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；PCR21載體（美國Invitrogen公司）。112DHBV陽性血清取自擴(kuò)增出DHBVDNA全長基因組
5、的陽性血清。113細(xì)胞禽類雞肝癌細(xì)胞系LMH，為本室傳代保存。114工具酶LATaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、Sacl、Kpnl、NotI及凝膠回收試劑盒（大連TAKARA公司）；TaqDNA聚合酶（美國Promega公司）；T4DNA連接酶（美國GIBIC0公司）。115生化及其它試劑地高辛（DIG）標(biāo)記及檢測試劑盒（德國Roche公司）；Waymouth細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；LipofectineTM2000（美國Invitrogen公司）oDNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒（德國QIAGEN公司）;質(zhì)粒
6、提取試劑盒和動物培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA純化試劑盒（大連TaKR公司）。12方法通過對湖北麻鴨DHBVDNA的全長克隆質(zhì)粒的序列限制酶切圖譜分析〔1〕，已明確其基因組的結(jié)構(gòu)及與復(fù)制相關(guān)的重要元件的序列位置，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用3片法構(gòu)建出能自我復(fù)制的重組質(zhì)粒。121構(gòu)建質(zhì)粒PCR21-DHBV15用EcoRI和BamHI雙酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA;設(shè)計引物DB1/DB2和DC1/DC2分別經(jīng)PCR擴(kuò)增DHBV陽性血清獲得目的片段DB和DC。將上述3片段插入PCR21的相應(yīng)酶切位點(diǎn)后即得到15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15
7、。122PCR鑒定引物Psl/Ps2和Pcl/Pc2為DHBV基因S區(qū)和C區(qū)的高度保守序列段，引物序列如下：Psl57-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3z,Ps25,-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3';Pcl57-GCAATCACTAGACCAATCCA-37，Pc25'-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3'。PCR反應(yīng)液組成：10XBuffer5ul；MgC123ul;dNTPlul;Psl/Ps2或Pcl/Pc2各1ul；Taq酶1y1;DHBV模板5y1；加滅菌純水至50nloPCR循環(huán)參數(shù)：94°C
8、5min；94°C50s，6l°C45s，72°C50s，40個循環(huán)；72oC10mino123酶切鑒定用BamHI，SacI和EcoRI，NotI和EcoRI，S
