鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達

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1、鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達作者：胡權(quán),張正茂,張小勇,張振華,雷延昌,周敦金,黃建國,楊東亮【摘要】目的構(gòu)建鴨乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通過體外細胞轉(zhuǎn)染獲得單一來源、基因序列清楚的體內(nèi)實驗的感染毒種。方法以湖北麻鴨DHBV分離株（DQ276978）為模板，用PCR法從該DHBV全基因組克隆質(zhì)粒（pMD-DHBV）和DHBV陽性血清中獲取3部分基因片段，總長44kb，克隆至載體PCR21的SacI和NotI酶切位點，構(gòu)建含15倍鴨乙型肝炎病毒全基因的重組質(zhì)粒，并酶切鑒定其插入方向。將構(gòu)

2、建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體LipofectineTM2000導(dǎo)入雞肝癌細胞系(LMH)細胞中轉(zhuǎn)染表達，收集純化后的轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清液作為體內(nèi)實驗感染的標(biāo)準(zhǔn)毒種。結(jié)果PCR鑒定、酶切鑒定及序列測定，證實成功獲得正向插入的1.5倍鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot檢測表明，該重組質(zhì)粒在LMH細胞內(nèi)存在各種病毒復(fù)制中間體；通過電鏡觀察，轉(zhuǎn)染細胞上清液中存在DHBV完整病毒顆粒。結(jié)論經(jīng)體外重組，構(gòu)建出攜帶1.5倍加長DHBV基因組片段的重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15，并可

3、在雞肝癌細胞LMH中介導(dǎo)高水平病毒復(fù)制，從而獲得含可自我復(fù)制病毒顆粒的轉(zhuǎn)染細胞上清液作為動物體內(nèi)感染接種物?！娟P(guān)鍵詞】鴨乙型肝炎病毒　　鴨乙型肝炎病毒（DHBV）與人類乙型肝炎病毒（HBV）同屬嗜肝DNA病毒科，它們在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因序列、病毒復(fù)制、致病機制及感染宿主規(guī)律等方面均較為相似，DHBV感染鴨模型使人們認(rèn)識了嗜肝病毒的復(fù)制周期以及病毒持續(xù)存在和病毒徹底清除的機制。我們在對湖北麻鴨DHBV自然感染率調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇對DHBV易感且取材方便的湖北麻鴨作為實驗鴨種，并分離出1株DHBV新毒株（DQ27697

4、8）〔1〕。進而以該毒株為模板，構(gòu)建了15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒，通過該質(zhì)粒在雞肝癌細胞系(LMH)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達出含有可自我復(fù)制的病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清液作為單一來源、基因序列清楚的實驗毒種，以期建立標(biāo)準(zhǔn)化的湖北麻鴨乙型肝炎病毒體內(nèi)模型。另外，將該DHBV重組質(zhì)粒與不同劑量人類載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LMH細胞，通過抑制實驗以證實該DHBV體外實驗?zāi)Ｐ偷某醪綉?yīng)用。　　1材料與方法　　11材料　　111質(zhì)粒pMD-DHBV為本實驗室構(gòu)建的含有湖北麻鴨（

5、DQ276978）DHBVDNA全長基因組的質(zhì)粒；pSP65-DHBV16為雙拷貝頭尾相接的全基因DHBVDNA重組質(zhì)粒，該克隆質(zhì)粒(美國Mandart教授饋贈)；APOBEC3G真核表達質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建保存；PCR21載體(美國Invitrogen公司)。　　112DHBV陽性血清取自擴增出DHBVDNA全長基因組（DQ276978）的陽性血清?！　?13細胞禽類雞肝癌細胞系LMH，為本室傳代保存?！　?14工具酶LATaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、NotI及

6、凝膠回收試劑盒(大連TAKARA公司)；TaqDNA聚合酶(美國Promega公司)；T4DNA連接酶(美國GIBICO公司)?！　?15生化及其它試劑地高辛(DIG)標(biāo)記及檢測試劑盒(德國Roche公司)；2000(美國Invitrogen公司)。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(德國QIAGEN公司)；質(zhì)粒提取試劑盒和動物培養(yǎng)細胞基因組DNA純化試劑盒(大連TaKR公司)?！　?2方法通過對湖北麻鴨（DQ276978）DHBVDNA的全長克隆質(zhì)粒的序列限制酶切圖譜分析〔1〕，已明確其基因組的

7、結(jié)構(gòu)及與復(fù)制相關(guān)的重要元件的序列位置，在此基礎(chǔ)上運用3片法構(gòu)建出能自我復(fù)制的重組質(zhì)粒?！　?21構(gòu)建質(zhì)粒PCR21-DHBV15用EcoRI和BamHI雙酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；設(shè)計引物DB1/DB2和DC1/DC2分別經(jīng)PCR擴增DHBV陽性血清獲得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。將上述3片段插入PCR21的相應(yīng)酶切位點后即得到15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15。　　1

8、22PCR鑒定引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2為DHBV基因S區(qū)和C區(qū)的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCT