基于差異基因表達譜的慢性乙型肝炎病證結(jié)合研究-論文.pdf

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1、2014年9月第31卷第5期廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報September2014，Vo1．31，No．5JournalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine693．臨床研究．基于差異基因表達譜的慢性乙型肝炎病證結(jié)合研究管艷，蘇式兵，毛海琴(1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405；2．上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)復(fù)雜系統(tǒng)研究中心，上海201203；3．云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南昆明650021)摘要：【目的】通過檢測分析慢性乙型肝炎(簡稱乙肝)典型證候的差異基因表達譜，探討乙肝中醫(yī)證候分型與基因表達之間的關(guān)聯(lián)?！痉椒ā坎杉?/p>

2、肝患者和健康者的外周血樣本，提取白細胞中的總RNA；運用基因芯片技術(shù)檢測基因表達，并對其表達譜進行比較分析；使用實時定量RT—PCR驗證部分基因表達?！窘Y(jié)果】乙肝患者與健康者之間以及乙肝肝郁脾虛證、濕熱蘊結(jié)證和肝腎陰虛證3個證候的患者之間的基因表達譜均存在明顯差異對3個證候組相對于健康組的差異表達基因進行差異基因、聚類、功能(geneontology，GO)分析和信號傳導(dǎo)通路(Pathway)分析發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛證單獨調(diào)變的基因主要與細胞動力學(xué)過程等有關(guān)：濕熱蘊結(jié)證單獨調(diào)變的基因主要與脂質(zhì)儲存的正向調(diào)節(jié)等有關(guān)：肝腎陰虛證單獨調(diào)變的基因主要與氮氧化合物合成酶調(diào)節(jié)物活性等有關(guān)

3、采用實時定量RT—PCR驗證部分基因的表達．結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果趨勢基本一致?！窘Y(jié)論】乙肝肝郁脾虛證、濕熱蘊結(jié)證和肝腎陰虛證患者白細胞具有特征性的基因表達譜和顯著性差異表達基因，提示乙肝中醫(yī)臨床辨證分型具有分子生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)關(guān)鍵詞：乙型肝炎；中醫(yī)證候；病證結(jié)合；基因；基因表達譜中圖分類號：R259．126文獻標志碼：A文章編號：1007—3213(2014)05—0693—06DoI：10．13359／j．cnki．gzxbtcm．2014．05．002慢性乙型肝炎(簡稱乙肝)是由乙肝病毒結(jié)果報道如下。(HBV)引起的一種世界性傳染性疾病。我國屬HBV感染的高發(fā)區(qū)．乙

4、肝患者約有3000萬．乙1對象與方法肝已經(jīng)成為嚴重的臨床和公共衛(wèi)生問題[中醫(yī)通1．1研究對象過辨證施治治療乙肝有著獨特的作用．而確定中醫(yī)本研究用于芯片檢測的為9例乙肝患者(肝郁證型是中醫(yī)辨證施治的前提因此。對乙肝進行中脾虛證3例、濕熱蘊結(jié)證3例、肝腎陰虛證3例)醫(yī)辨證客觀化、規(guī)范化的研究具有重要意義。隨著和3例健康者：用于驗證芯片結(jié)果的為30例乙肝系統(tǒng)生物學(xué)研究和組學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展．運用大規(guī)患者(肝郁脾虛證1O例、濕熱蘊結(jié)證1O例、肝腎模、高通量的基因芯片檢測技術(shù)，對乙肝證候的基陰虛證10例)和10例健康者。乙肝患者均來自上因表達譜進行定量分析．闡明證候分型的分子生物海

5、中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院．健康者來自健康志愿學(xué)基礎(chǔ)．已成為可能．也是我們研究證候客觀化的者．并簽署知情同意書基礎(chǔ)工作之一因此．本研究采集健康者和乙肝31．2診斷標準種典型證候(肝郁脾虛證、濕熱蘊結(jié)證、肝腎陰虛慢性乙型肝炎診斷和分期標準參照中華醫(yī)學(xué)會證)的臨床信息和血液樣本，采用生物芯片技術(shù)，肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會制訂的《慢性乙型肝炎檢測并分析健康者和乙肝不同證候的差異表達基因防治指南》l2l。證候診斷標準參照中華中醫(yī)藥學(xué)會及其表達譜．試圖從基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)闡釋乙肝與健康內(nèi)科肝病委員會提出的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準者之間、乙肝不同證候發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)．從(試行)》[。基因

6、水平對乙肝進行“病證結(jié)合”研究．以探討乙1．3標本采集肝與健康者及乙肝不同證候之間的差異?，F(xiàn)將研究采集乙肝患者及健康者晨起空腹靜脈血3mL，收稿日期：2014—．04．24作者簡介：管艷(1985一)，女，2012級博士研究生；E-mall：guanyansue@163．con]通訊作者：毛海琴(1978一)，女，講師；E-mail：Mao1978hq@163．com基金項目：國家科技重大專項課題(編號：2009ZX10004—601)694廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報2014年第3l卷保存于含有150ILL乙二胺四乙酸(EDTA)的個探針．可檢測44049個基因使用GenePi

7、x2mL凍存管內(nèi)．一20~C保存。4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度．并將實驗1．4RNA抽提和質(zhì)量檢測結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存．使用配套軟件對原始采用TRIzolReagent(美國Invitrogenlife數(shù)據(jù)進行分析運算technologies公司)進行全血白細胞RNA提取和純1．7芯片數(shù)據(jù)處理和分析化．操作流程嚴格按照試劑盒說明書進行。使用利用GenePix分析軟件．對掃描的圖像進行圖NanoDropND一1000進行質(zhì)量檢測．D260／D280在像一數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換．剔除一些不可靠基因點值．包括1．8～2．1之間為合格剔除熒光值