腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎溫針療效的差異基因表達(dá)譜研究

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1、第34卷第4期云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)Vol．34No．42011年8月JournalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine8．2011*腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎溫針療效的差異基因表達(dá)譜研究12△2譚從娥，王米渠，陸明(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046;2．成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610075)［摘要］目的:探討溫針治療腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制，為其療效提供科學(xué)依據(jù)。方法:根據(jù)腎陽(yáng)虛證評(píng)定量表，選

2、取典型腎陽(yáng)虛證患者10名給予溫針治療兩周，然后以其中療效最好的4例治療前后作基因芯片雜交測(cè)試，采用SAM基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件，篩選顯著表達(dá)基因作進(jìn)一步的基因功能分析。結(jié)果:4例患者皆為典型腎陽(yáng)虛證，經(jīng)溫針治療后效果明顯。通過(guò)SAM軟件篩選到32個(gè)顯著表達(dá)基因，基因功能注釋結(jié)果提示炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類(lèi)基因顯著表達(dá);分子通路主要集中于免疫及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。討論:溫針治療腎陽(yáng)虛證膝骨關(guān)節(jié)炎的療效的分子機(jī)制是多方面的，涉及到炎癥反應(yīng)、免疫功能、信號(hào)系統(tǒng)等多方面的修復(fù)作用。［關(guān)鍵詞］腎陽(yáng)虛證;骨關(guān)節(jié)炎;溫針;差異基因表達(dá)譜中圖分類(lèi)號(hào):R241文獻(xiàn)

3、標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1000—2723(2011)04—0004—03腎陽(yáng)，又稱(chēng)命門(mén)之火，為人體陽(yáng)氣之根本，腎三里(雙)、膝眼(雙)、陽(yáng)陵泉(雙)。選用華陽(yáng)虛的程度與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，加佗牌針具針刺穴位，行針得氣后留針，將華佗牌艾之久病及腎，故腎陽(yáng)虛證在臨床上極為常見(jiàn)。腎主條切成2cm1個(gè)，置于針柄上行溫針灸，每次2壯骨生髓，中醫(yī)腎的概念與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病理論上有著約40min。每日1次，共治療14次。密切的關(guān)系。因此，本文借助中西醫(yī)病證結(jié)合的方1.3芯片實(shí)驗(yàn)法，選取中醫(yī)證為典型的腎陽(yáng)虛證，西醫(yī)診斷為單4例患者分別于治療前、后

4、采血10mL，分離純膝骨關(guān)節(jié)炎的患者作為研究對(duì)象給予溫針治療。獲得白細(xì)胞，用TRIzol一步法提取細(xì)胞中的總選擇其中療效最佳的病例，治療前后對(duì)照作基因芯RNA，通過(guò)異丙醇沉淀法濃縮RNA，使用10μg治片，對(duì)治療前后的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能注療前后的實(shí)驗(yàn)樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用釋?zhuān)瑸闇蒯樂(lè)肿盈熜гu(píng)定奠定基礎(chǔ)。北京博奧生物芯片有限公司制備的cDNA人類(lèi)全基1資料與方法因組表達(dá)譜芯片，將治療前后的樣品分別用cy3和1.1研究對(duì)象cy5標(biāo)記，標(biāo)記后的樣品同時(shí)與芯片上的21329克在中國(guó)四川省彭州市大保鄉(xiāng)山區(qū)作腎陽(yáng)虛證調(diào)隆點(diǎn)進(jìn)行雜

5、交，芯片用ScanArray急速的雙通道激查過(guò)程中，根據(jù)自編的40項(xiàng)腎陽(yáng)虛辨證因子量光掃描儀進(jìn)行掃描。再采用GenePix4.0圖像分析［1，2］表為評(píng)分細(xì)則進(jìn)行評(píng)分，選取年齡為40歲以軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字上，男女比例相近的典型腎陽(yáng)虛證患者10名，符信號(hào);然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸合1991年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)推薦的膝骨關(guān)節(jié)炎診斷一化，最后ratio值為治療后/治療前。差異基因篩［3］標(biāo)準(zhǔn)，給予溫針治療，然后以其中療效最好的4選標(biāo)準(zhǔn)采用倍數(shù)分析的方法，即以ratio＞或=2為例于溫針治療前后采血對(duì)照

6、作基因芯片。上調(diào)基因，ratio＜或=0.5為下調(diào)基因。1.2溫針治療方案1.4基因芯片數(shù)據(jù)分析對(duì)上述10例腎陽(yáng)虛證患者取關(guān)元、氣海、足采用SAM(SignificantAnalysisofMicroarray)*基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:81072731)收稿日期:2011—07—13作者簡(jiǎn)介:譚從娥(1972～)，女，陜西柞水人，講師，博士。研究方向:證的分子調(diào)控機(jī)制研究?！魍ㄓ嵶髡?王米渠，E－mail:miquwang@163.com。4第4期譚從娥，等:腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎溫針療效的差異基因表達(dá)譜研究芯片數(shù)據(jù)分析

7、軟件分析家系差異表達(dá)基因。SAM2.2基因芯片檢測(cè)結(jié)果是由Standford大學(xué)開(kāi)發(fā)的一個(gè)微陣列顯著性分析2.2.1顯著表達(dá)基因篩選軟件，目前已廣泛被學(xué)術(shù)界所采用。SAM采用基4例患者溫針治療前后樣品雜交，基因芯片數(shù)因特異性t檢驗(yàn)，通過(guò)控制假陽(yáng)性率(FalseDis-據(jù)處理得到4組基因表達(dá)數(shù)據(jù)。將4組基因表達(dá)信［4，5］coveryRate，F(xiàn)DR)來(lái)篩選統(tǒng)計(jì)顯著性基因。號(hào)值輸入SAM分析軟件，取FDR為非0最小值時(shí)對(duì)于大多數(shù)的基因芯片分析，通常要求FDR很小，的基因數(shù)目為入選基因，當(dāng)Delta=0.70，F(xiàn)DR=這樣才能保證較少的假

8、陽(yáng)性基因通過(guò)檢驗(yàn)。但是如0.15時(shí)共篩選到特征表達(dá)基因32個(gè)，其中上調(diào)基果FDR取值為0，則可能會(huì)有較多的假陰性錯(cuò)誤，因4個(gè)，下調(diào)基因28個(gè)。SAM輸出散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1，所以本文中FDR取一定Delta值控制下的非0最小紅色