老齡腎陽(yáng)虛證的差異表達(dá)基因譜分析

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1、老齡腎陽(yáng)虛證的差異表達(dá)基因譜分析作者：李煒弘雍小嘉范懷昌譚從娥張?zhí)於鹜趺浊菊磕康牟捎没虮磉_(dá)譜芯片技術(shù)，分析老齡腎陽(yáng)虛證的發(fā)生與基因表達(dá)異常間的聯(lián)系。方法篩選腎陽(yáng)虛證患者3名和正常對(duì)照者3名，采用美國(guó)Affymetrix公司的HG-u133Plus2.0基因表達(dá)譜芯片，通過(guò)組間比較，篩選出老齡腎陽(yáng)虛患者差異表達(dá)基因。結(jié)果芯片數(shù)據(jù)組間比較分析后獲得34條差異表達(dá)基因，聚類分析得到6條有特征性地差異表達(dá)基因，主要涉及細(xì)胞周期和凋亡，腫瘤發(fā)生以及免疫。結(jié)論老齡腎陽(yáng)虛證的發(fā)生涉及一系列免疫紊亂的復(fù)雜的過(guò)程，可能與個(gè)體的衰老存在密切關(guān)聯(lián)?！娟P(guān)鍵詞】腎陽(yáng)虛證差異表達(dá)基因免疫衰老Abstra

2、ct：ObjectiveToexploretherelevancebeteandthedifferentiallyexpressedgenesbycDNAarrary.MethodsThreekidney-Yangdeficiencypatientsandthreehealthypeopleplesduringtheepidemiologicsurveyofthekidney-Yangdeficiencysyndrome.ThedifferentiallyexpressedgenesetrixGeneChip.Results34mondifferentiallyexpressedge

3、nesorigenesisandimmunityeisrelatedtothedysfunctionoftheimmunesystem,maybeclosedrelatedtobodyagEingasmuneresponse;AgEIng隨著人類基因組計(jì)劃的深入，尤其是功能基因組學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，在基因表達(dá)譜芯片技術(shù)平臺(tái)上［1］開展的“證候-基因表達(dá)譜”研究從一個(gè)新的視角，系統(tǒng)、全面地深化人們對(duì)中醫(yī)證候的認(rèn)識(shí)，把證候與分子網(wǎng)絡(luò)的功能聯(lián)系起來(lái)。在以往對(duì)腎陽(yáng)虛的研究中，已進(jìn)行腎陽(yáng)虛半定量化操作標(biāo)準(zhǔn)［2］以及虛寒證、心陽(yáng)虛證等基因芯片實(shí)驗(yàn)研究［3］提示，腎陽(yáng)虛證一定具有特定的分子生物學(xué)

4、基礎(chǔ)；腎陽(yáng)虛的辨證論治其理其法在基因水平、分子水平有深層次的科學(xué)依據(jù)。研究中還發(fā)現(xiàn)年齡是“證”的基因表達(dá)不可忽略的影響因素，而腎陽(yáng)虛證在老齡人群中占有較大比例。結(jié)合多年“證候－基因組”研究的經(jīng)驗(yàn)，筆者選用國(guó)際公認(rèn)的美國(guó)Affymetrix公司的人全基因組表達(dá)譜芯片，開展了特定老齡人群腎陽(yáng)虛證的差異基因表達(dá)譜的分析研究，探討老齡腎陽(yáng)虛證所涉及的分子生物學(xué)過(guò)程，為進(jìn)一步揭示腎陽(yáng)虛證的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。1研究對(duì)象在60歲以上老齡人群腎陽(yáng)虛證的流行病學(xué)調(diào)查過(guò)程中篩選了3例腎陽(yáng)虛證患者，年齡在60～70歲之間，體檢無(wú)西醫(yī)診斷的器質(zhì)性疾病，經(jīng)中醫(yī)專家診斷和腎陽(yáng)虛證量表［2］評(píng)分相結(jié)合，符合典型腎陽(yáng)虛

5、證診斷。另外，選取同年齡段、性別一致的3例健康老人為正常對(duì)照，此3例對(duì)照者經(jīng)體檢，均無(wú)西醫(yī)診斷的器質(zhì)性疾病，無(wú)身體不適癥狀，并經(jīng)過(guò)中醫(yī)專家診斷和腎陽(yáng)虛證量表評(píng)分，均無(wú)腎陽(yáng)虛臨床表征。2方法2.1提取總RNA分別采取腎陽(yáng)虛證患者與正常人的空腹靜脈血10ml，裂解紅細(xì)胞，分離獲得白細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，并對(duì)總RNA進(jìn)行定量、質(zhì)檢。2.2基因芯片檢測(cè)利用單輪cRNA擴(kuò)增、生物素標(biāo)記法對(duì)樣品進(jìn)行靶標(biāo)制備，然后用于芯片雜交；芯片采用美國(guó)Affymetrix公司的HG-u133Plus2.0基因表達(dá)譜芯片，每例樣品檢測(cè)1張，共6張。用FluidicsStation450進(jìn)行洗脫和

6、染色，然后用Scanner3000掃描芯片；用GeneChipOperatingsoftetrix公司寡核苷酸芯片檢測(cè)結(jié)果已得到國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)界的公認(rèn)。采用成組T檢驗(yàn)的方法分析結(jié)果，用foldchange大于1.5或者小于0.6667，pvalue小于0.05，得到腎陽(yáng)虛證組與健康對(duì)照組間的差異表達(dá)基因34個(gè)，其中表達(dá)水平下調(diào)的有28條基因，表達(dá)水平上調(diào)的僅有6條基因。見表2。3.2.2腎陽(yáng)虛證差異表達(dá)基因的聚類分析采用Cluster3.0對(duì)上述34條基因進(jìn)行聚類分析，如圖1所示。腎陽(yáng)虛證組和健康對(duì)照組間有6條基因有明顯的組間辨識(shí)特征。見表3。表16例樣本腎陽(yáng)虛證各癥狀因子及其定量評(píng)分

7、結(jié)果（略）sh1，sh2，sh3為3例典型腎陽(yáng)虛證患者，腎陽(yáng)虛證半定量診斷總分值分別為36，29，36;h1，h2，h3為3例健康對(duì)照者，腎陽(yáng)虛證半定量診斷總分值分別為3，2，5表2腎陽(yáng)虛證差異表達(dá)基因（略）表3腎陽(yáng)虛證特征差異表達(dá)基因（略）圖1腎陽(yáng)虛證差異表達(dá)基因聚類圖（略）4討論4.1實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制既往對(duì)腎陽(yáng)虛證病機(jī)、診斷、治療、生理、生化、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)控等研究，提示該證很可能涉及一大群差異表達(dá)基因，擁有復(fù)雜而獨(dú)特的分子生物學(xué)內(nèi)涵［4］?；蛐?/p>