犬細(xì)小病毒蜂膠滅活苗的制備及治療用卵黃抗體的研制.pdf

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1、一288一江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2010年第3期魯敏，張婧蘭，黃克和．犬細(xì)小病毒蜂膠滅活苗的制備及治療用卵黃抗體的研制[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(3)：288—290犬細(xì)小病毒蜂膠滅活苗的制備及治療用卵黃抗體的研制魯敏，張婧蘭，黃克和。(1．江蘇省協(xié)同生物工程責(zé)任有限公司，江蘇南京210041；2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095；3．南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210093)摘要：將犬細(xì)小病毒(cpv)的弱毒苗接種于單層FS1細(xì)胞上，大量增殖病毒，并制成CPV蜂膠滅活苗。其后對(duì)蛋雞進(jìn)行連續(xù)3次免疫，定期收集雞蛋，提取蛋黃中的卵黃抗體(I

2、gY)。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)CPV卵黃抗體效價(jià)，結(jié)果表明，通過(guò)本方法能獲得穩(wěn)定的犬細(xì)小病毒卵黃抗體，10d后抗體水平維持在1：320以上。關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；蜂膠滅活苗；卵黃抗體；ELISA中圖分類號(hào)：$852．655文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002—1302(2010)03—0288—03犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(canineparvovirus，CPV)碳酸鹽緩沖液)、洗滌液(PBS—T，pH值7．4)、封閉液引起的以劇烈嘔吐、出血性腸炎和白細(xì)胞顯著減少為主要特(1％BSA)、酶標(biāo)抗體HRP一兔抗雞IgY(博奧森生物有限公征的一種高度接觸

3、性傳染病，在幼犬中具有相當(dāng)高的發(fā)病率司)、底物緩沖液(pH值5．0磷酸一檸檬酸鈉緩沖液)、底物與死亡率。利用超免雞將CPV特異性抗體穩(wěn)定持續(xù)地傳至鄰苯二胺(OPD)(南京博全科技)、終止液(2mol／LH：SO)。卵黃中，制備特異性多克隆抗體，成本低且產(chǎn)量高，有望成為1．2試驗(yàn)方法治療犬細(xì)小病毒病的有效手段。與產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物的IgG相1．2．1血清濃度對(duì)CPV在FS1細(xì)胞上增殖的影響FS1細(xì)比，來(lái)自禽的IgY具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(i)無(wú)需采血，只需胞長(zhǎng)滿后用0．05％EDTA和0．25％胰酶消化，取100mL細(xì)收集免疫母雞產(chǎn)下的雞蛋即可獲得抗體；

4、(2)使用少量的抗胞培養(yǎng)瓶9個(gè)，分為3組，在接種細(xì)胞的同時(shí)接種病毒，接占原免疫禽類即可獲得大量的質(zhì)量均一的特異性IgY；(3)由于培養(yǎng)液量10％的弱毒苗，1、2、3組分別為含2％、5％、8％小種系發(fā)生距離相差很大，禽類IgY與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白之牛m清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO：培養(yǎng)24h后換含小間不會(huì)發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)；(4)不激活哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體系牛血清2％的DMEM維持液。定時(shí)將每組的3個(gè)培養(yǎng)瓶的毒統(tǒng)，不與類風(fēng)濕因子或Fc受體相結(jié)合，避免在免疫檢測(cè)過(guò)程液取出，混勻取樣0．5mL后，剩余毒液均放回培養(yǎng)瓶中繼續(xù)中產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果；(

5、5)耐熱、耐酸，巴氏滅菌溫度培養(yǎng)，如此反復(fù)取毒，測(cè)定毒液的TCID。。收毒：下也不會(huì)失活，并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IgY活性在pH值3～3．5時(shí)活一20oC／37℃反復(fù)凍融3次后，4℃下3000r／min離心性才發(fā)生下降，且胃蛋白酶的破壞作用小，因此IgY能口服；20rain，收集上清液作為毒種。(6)安全。服用IgY安全可靠，用治療劑量(80300mg／kg)的1．2．2測(cè)定病毒的TCID。各時(shí)間段采集的毒液及毒種按10—40倍劑量進(jìn)行試驗(yàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)。本試驗(yàn)通10～～10的濃度梯度稀釋后，每個(gè)梯度以維持液10％的量過(guò)大量增殖CPV病毒，制備蜂膠滅

6、活苗，免疫蛋雞，獲得較高同步接種于F81細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞CPE，具體操效價(jià)的CPV卵黃抗體，并對(duì)抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，旨在為其在作及計(jì)算方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。生產(chǎn)及犬臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1．2．3病毒鑒定中和試驗(yàn)：以濃度為1O的毒種與等量的CPV單克隆抗體37℃下感作30min，并用等量的10濃1材料與方法度毒種作對(duì)照，分別同步接毒F81細(xì)胞后進(jìn)行觀察。1．1試驗(yàn)材料1．2．4蜂膠滅活疫苗的制備(1)將收集的毒液加終濃度CPV疫苗(英特威公司生產(chǎn))；F81細(xì)胞(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)為0．1％的甲醛(邊加邊振蕩，使其充分混勻)，置37℃滅活

7、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供)；CPV單克隆抗體(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫18—24h，每2h振蕩一次，4℃保存。(2)稱取蜂膠1份研技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；小牛血清(中美合資碎，加入4份95％乙醇，置室溫下浸漬24h，然后4℃冰箱冷蘭州民海生物工程有限公司)；天然蜂膠(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物卻，2500r／min離心10min，取上清液，即為純化的蜂膠乙醇醫(yī)學(xué)院提供)；25周齡伊莎蛋雞20羽(溧水秋湖山生態(tài)養(yǎng)殖浸提液。根據(jù)蜂膠的純度，計(jì)算出其中干物質(zhì)的含量，配成基地提供)；PEG6000(Biosharp公司生產(chǎn)，南京博全科技分20mg／mL的溶

8、液，置4cC冰箱保存?zhèn)溆谩?3)將滅活的病毒裝)；96孔酶標(biāo)板(上海生工生物技術(shù)有限公司)。液與蜂膠乙醇浸提液按體積比3：1混合，4℃保