硝酸還原酶活力測定.ppt

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1、實驗六硝酸還原酶活性的測定為什么要測定硝酸還原酶活性？？!55％21％24％植物生理生化實驗一、測定意義硝酸還原酶（NR）是硝酸鹽同化中第一個酶，也是限速酶，處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置。它與植物吸收利用氮肥有關(guān)，對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，因而硝酸還原酶活性被當作植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標之一，也可作為品種選育的指標之一。植物的氮源空氣中含有近80%的氮氣(N2),但植物卻無法直接利用這些分子態(tài)氮。只有某些微生物(包括與高等植物共生的固氮微生物)才能直接同化利用分子態(tài)氮，而植物所利用的氮源,主要來自土壤.。植物主要利用土壤

2、中的含氮化合物：1、土壤中的有機含氮化合物主要來源于動物、植物和微生物軀體的腐爛分解的產(chǎn)物。但這些含氮化合物大多是不溶性的,通常不能直接為植物所利用，植物只能吸收其中的氨基酸、酰胺、尿素、水溶性的有機氮化物。。2、無機氮化物(以銨鹽和硝酸鹽為主)銨態(tài)氮(NH+4)植物可直接吸收、利用并合成氨基酸硝態(tài)氮(NO-3)必須經(jīng)過還原形成銨態(tài)氮后才能被利用。硝酸鹽的還原在一般的土壤條件下，NO-3是植物吸收的主要形式。NO-3進入細胞后被硝酸還原酶(NR)和亞硝酸還原酶(NiR)還原成銨。其中NR是這一反應(yīng)的限速酶。NRNiR硝酸

3、還原酶催化硝酸鹽還原為亞硝酸：NO-3+NAD(P)H+H+NO-2+NAD(P)++H2ONR亞硝酸還原酶催化亞硝酸鹽還原為銨：硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，誘導(dǎo)物是NO3-，光照可促進硝酸鹽的還原過程。誘導(dǎo)酶：又稱適應(yīng)酶，指植物體內(nèi)本來不含有，但在特定外來物質(zhì)的誘導(dǎo)下可以生成的酶。如硝酸還原酶可為NO3-所誘導(dǎo)。例如，水稻幼苗本無硝酸還原酶，但如果培養(yǎng)在硝酸鹽溶液中，水稻體內(nèi)就會誘導(dǎo)生成硝酸還原酶，這是高等植物中底物誘導(dǎo)的實例。離體法：需將材料磨成勻漿，經(jīng)過低溫離心除去殘渣，吸取上清液為硝酸還原酶粗酶液進行測定。由于研磨中

4、NADH受損失，必需外加NADH方可測定。硝酸還原酶活性測定方法：活體法：直接用鮮活組織進行測定。環(huán)境中的NO-2進入細胞后，被硝酸還原酶還原成NO-2并擴散到細胞外在溶液中積累，測定溶液中NO-2的含量即可得知硝酸還原酶活性的大小。活體法不破壞細胞原有的酶反應(yīng)系統(tǒng)，NADH可由代謝反應(yīng)不斷生成，無需外加。六、操作步驟七、結(jié)果計算八、思考題九、注意事項一、意義及目的要求二、原理三、儀器設(shè)備四、試劑配制五、實驗材料實驗六硝酸還原酶活性的測定(活體法)55％21％24％植物生理生化實驗1、了解NR測定對植物氮代謝的重要意義及

5、實際應(yīng)用。2、了解離體法和活體法測定NR的不同點。3、掌握活體法測定NR的原理及其技術(shù)要點。4、掌握測定過程相關(guān)儀器的使用方法。二.目的要求三、原理：硝酸還原酶可以將NO3-還原成NO2-，其反應(yīng)為：NO3-+NADH+H+NO2-+NAD++H2O在一定條件下，NO2-的生成量與硝酸還原酶活性呈正相關(guān)。NO2-含量可用磺胺顯色法測定，即在酸性條件下與對-氨基苯磺酰胺發(fā)生重氮反應(yīng)，生成的重氮化合物又與N-萘基乙二胺鹽酸鹽（或α-萘胺）生成紅色偶氮化合物，可在540nm下比色測定。反應(yīng)如下：NR四、儀器設(shè)備1、0.2mol

6、/L硝酸鉀2、0.1mol/L的磷酸緩沖液，pH=7.5A液：0.2mol/LNaH2PO4B液：0.2mol/LNa2HPO43、1%磺胺4、0.02%萘基乙烯胺5、亞硝酸鈉標準液6、30%三氯乙酸五、試劑配制六、實驗材料:甘薯葉片1、取樣及反應(yīng)：將甘薯葉片洗干凈吸干，用打孔器取大小一致的小圓片，混合均勻，迅速稱取0.5克樣品3份，分別置于3個50毫升三角瓶中。七操作步驟及注意事項：瓶號試劑（ml）1(對照)2(測定瓶)3(測定瓶)30%三氯乙酸1000.1mol/LKNO3999放入真空干燥箱抽氣時間10min10m

7、in10min放入恒溫培養(yǎng)箱30℃暗處30min30min30min30%三氯乙酸01155％21％24％2、NO-2的測定：試管編號對照樣1樣2反應(yīng)液(ml)1111%磺胺試劑(ml)2220.02%萘基乙烯胺(ml)222顯色時間15min540nmOD值o??每管含NO-2的μg數(shù)0??55％21％24％根據(jù)測定的OD值，從標準曲線查出NO-2濃度（OD值/0.307=μg）代入以下公式：NR活性(μgNO-2/g鮮葉/h)＝八.結(jié)果計算：查標準曲線得NO-2濃度（μg）×10ml0.5g×0.5小時×1ml九、注

8、意事項1.取樣前葉子需進行一段時間的光合作用，以積累碳水化合物，否則酶活性低。2.葉片要用打孔器取樣(或用剪刀剪成大小一致的小塊)。3.無機磷對NR活力有促進作用，因此常用磷酸緩沖液。4.活體法酶促反應(yīng)在暗條件下進行，以防止亞硝酸鹽還原為氨。5.亞硝酸的磺胺比色法比較靈敏，顯色速度受溫度和酸度等因素的影響。因此標準液