硝酸還原酶活性測定

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1、實驗八硝酸還原酶活性測定一、目的硝酸還原酶是植物氮素代謝中的關(guān)鍵酶之一，它與作物吸收利用氮肥有關(guān)，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。因而可以把硝酸還原酶的活力當(dāng)作植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一。通過本實驗可初步掌握測定硝酸還原酶活性的原理與方法。二、原理硝酸還原酶能將NO3－還原成NO2－產(chǎn)生的NO2－的量與硝酸還原酶的活性相關(guān)。通過測定反應(yīng)液中產(chǎn)生的NO2－含量，即可確定酶活性大小。NO2－含量可用磺胺顯色法測定。NO2－與磺胺及a－萘胺在酸性條件下生成紅色偶氮化合物其反應(yīng)如下：酶活性可用單位鮮重組織在單位時間內(nèi)產(chǎn)生的亞硝酸量來表示：亞硝酸態(tài)氮微克數(shù)/克鮮重組織1小時。三

2、、實驗材料、儀器和試劑1．實驗材料植物的根、莖、葉，本實驗選用白蘿卜葉片2．儀器（1）分光光度計（2）離心機（3）真空泵和真空干燥器（4）恒溫水浴鍋（5）恒溫箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml）（7）試管（8）天平（9）三角瓶（50ml）3．試劑（1）亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：稱取0.1000g亞硝酸鈉（AR），用蒸餾水溶解并定容至100ml。然后吸取5ml再用蒸餾水定客至1000m1。即為濃度5μg／ml的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。（2）0.lmol·L－1pH7.5磷酸緩沖液（3）0.2mol·L－1的硝酸鉀溶液（4）1％對氨基苯磺磷酸（5）2％α－萘胺（6）30％三氯乙酸四、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制

3、作取6支試管，編號，按下表操作操作項目管號123456NaNO2淀標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.40.81.21.62.0蒸餾水(ml)2.01.61.20.80.40NaNO2含量（μg）0246810磺胺(ml)各4α－萘胺各4搖勻在30℃水浴中保溫20分鐘。然后在520ml波長下比色測定消光值。以亞硝酸鈉含量為橫坐標(biāo)，消光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．酶反應(yīng)和酶活性測定將白蘿卜葉片洗靜，剪成0.5cm2h的小片，混勻后稱三份，每份0.5－1.0g，分另放人50ml的三角瓶中，編號按下表加試劑搖勻，置真空于燥器中，抽氣10分鐘。然后將三角瓶放人恒溫箱，在30℃暗條件下保溫30分鐘。取出后向2，3號瓶

4、中分別加人lml30％三氯乙酸終止反應(yīng)，將反應(yīng)液離心（3000rmp10分鐘）或過濾。分另吸取2ml反應(yīng)液于三只試管中各加4ml1％磺胺和0.2％a－萘胺。搖勻在30℃水浴中保溫20分鐘。然后在520ml波長下比色測定消光值。五、結(jié)果與計算酶活性（亞硝酸鈉μg／g鮮重·h）＝亞硝酸鈉微克數(shù)（μg）×稀釋倍數(shù)／樣品重（g）×?xí)r間（h）六、注意事項1．酶促反應(yīng)在暗條件下進行，以防光照下葉綠體形成還原型鐵氧還蛋白，促使亞硝酸還原酶把NO2還原成NH3。2．田間采樣應(yīng)在早晨9點以后，光合作用進行了一段時間再進行。