硝酸還原酶活性的測定

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1、趙志杰，史國安，董新純編的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》）參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》,P27～29硝酸還原酶活性的測定原理硝酸還原酶是植物氮素代謝作用中關(guān)鍵性酶，與作物吸收和利用氮簡單易行，在一般條件下都能做到。紅色的偶氮染料。反應(yīng)液的酸度大則增加重氮化作用的速度，但降低偶聯(lián)作用的速度，顏色比較穩(wěn)定。增加溫度可以增加反應(yīng)速度，但降低重氮鹽的穩(wěn)定度，所以反應(yīng)需要在相同條件下進行。這種方法非常靈敏，能測定每ml含0.5μg的NaNO2。儀器藥品721型分光光度計真空泵（或注射器）保溫箱天平真空干燥器鉆孔器三角燒瓶移液管燒杯0.1mol/L

2、磷酸緩沖液，pH7.5（見附表2）。0.2mol/LKNO3：溶解20.22gKNO3于1000ml蒸餾水中?；前吩噭?g磺胺加25ml濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至100ml。α—萘胺試劑：0.2gα—萘胺溶于含1ml濃鹽酸的蒸餾水中，稀釋至100ml。NaNO2標準溶液：1gNaNO2用蒸餾水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸餾水稀釋成1000ml，此溶液每ml含有NaNO25μg，用時稀釋之。操作步驟1.．將新鮮取回的葉片（蓖麻、煙草、向日葵、油菜、小麥、棉花等均可）水洗，用吸水紙吸干，然后用鉆孔器鉆成直徑約1cm的圓片，用蒸餾水洗滌2梍

3、3次，吸干水分，然后于臺天平上稱取等重的葉子圓片兩份，每份約0.3—0.4g（或每份取50個圓片），分別置于含有下列溶液的50ml三角燒瓶中：(1)0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.5)5ml+蒸餾水5ml；(2)0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/LKNO35ml。然后將三角燒瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣，放氣后，圓片即沉于溶液中（如果沒有真空泵，也可以用20ml注射器代替，將反應(yīng)液及葉子圓片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽氣放氣反復(fù)進行多次，即可使圓片中的空氣抽去

4、而沉于溶液中）。將三角燒瓶置于30℃溫箱中，使不見光，保溫作用30分鐘，然后分別吸注意取樣前葉子要進行一段時間的光合作用，以積累碳水化合物，如果組織中的碳水化合物含量低，會使得酶的活性降低，此時則可于反應(yīng)溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能顯著增加保溫30分鐘結(jié)束時，吸取反應(yīng)溶液1ml于一試管中，加入磺胺試劑2ml及α—萘胺試劑2ml，混合搖勻，靜置30分鐘，用比色計進行比色測3.．繪制標準曲線與重氮化作用及偶聯(lián)作用的速度有關(guān)，溫度、酸濃度等都影響顯色速度，同時也影響靈敏度，但如果標準與樣品的測定都在相同條件下進行，則顯色速度

5、相同，彼此可以比較。吸取不同濃度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于試管中，加入磺胺試劑2ml及α—萘胺試劑2ml，混合搖勻，靜置30分鐘（或于一定溫度的水俗中保溫30分鐘），立即于分光光度計中進行測定，測定時的波長為520nm，比色，讀取吸光度或透光率。然后，以吸光度為縱坐標，NaNO2濃度為橫坐標。于毫米方格紙上繪制吸光度—濃度曲線。實驗作業(yè)1．試比較不同植物的酶活性。2．試比較取樣前植物處于照光或黑暗條件下酶活性的不同。參考文獻1．陳薇、張德頤：1980。植物組織中硝酸還原酶的提取測定和純化，植物生理學(xué)通訊，

6、1980(4)：45—49。2．周樹、鄭相穆：1985。硝酸還原酶體內(nèi)分析方法的探討，植物生理學(xué)通訊，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.andD.P.．Hucklesby:1971.MethodsinEnzymology,23A:491—503.4．Radin.J.W.:1973.PlantPhysiology,51:332—336.5．Snell,F.D.andC.T.Snell:1949.ColorimetricMethodsofAnalysis,Vol.II,802—807硝酸還原酶(NR)的測定采用離體法：（1g樣）

7、（參考陳建勛，王曉峰主編的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》,P27～29）亞硝酸鈉標準溶液（1μg/ml）：稱NaNO20.9857g,定容到1000ml，再吸5ml定容到1000ml。0.1mol/LpH7.5的磷酸緩沖溶液：30.0905gNa2HPO4·12H2O+2.4965gNaH2PO4·2H2O，加蒸餾水定容到1000ml。3mol/LHCl：125ml濃鹽酸加蒸餾水定容到500ml。1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml3mol/LHCl中。0.2％a-萘胺溶液：1.0ga-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸餾水定容到500ml，貯于棕色瓶中

8、。0.1mol/LKNO3溶液：5.055gKNO3溶于500mln0.1mol/LpH7.5的磷酸緩沖溶液。0.025mol/LpH8