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1、重組腺病毒的構(gòu)建腺病毒Adenovirus最初由人類腺樣增殖體組織培養(yǎng)中分離得到的，此病毒名稱也由此而來。質(zhì)粒是直徑約70毫微米的正二十面體，各頂點(diǎn)具有突起。結(jié)構(gòu)亞基總數(shù)為252個。核酸是雙鏈DNA，分子量20—25×106。無包膜。在被感染的細(xì)胞核中增殖，病毒蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，再輸送到細(xì)胞核。腺病毒可見于人、雞、牛、狗、鼠、豬和猴中，并各自具有嚴(yán)格的寄主特異性，不感染他種動物。對人類可引起感冒癥狀、呼吸系統(tǒng)不適等。腺病毒腺病毒是一種大分子線性雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞
2、內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中.ITRΨE1a/E1bE2E3E4ITR腺病毒的基因及其功能腺病毒基因組編碼數(shù)十個腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，分為早期表達(dá)和晚期表達(dá)。早期表達(dá)的蛋白是功能蛋白，晚期表達(dá)的有功能蛋白也有結(jié)構(gòu)蛋白，并且早期的功能蛋白能夠調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。早期表達(dá)的E1區(qū)蛋白（甚至包括E2區(qū)蛋白）是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必須的，但其對細(xì)胞毒性也是很強(qiáng)的。E2蛋白涉及AdDNA復(fù)制E3蛋白對抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng)E4蛋白調(diào)
3、節(jié)有效的晚期基因轉(zhuǎn)錄腺病毒分類第一代腺病毒載體：一般將E1或E3基因缺失的腺病毒載體成為一代載體。此類型載體在未純化時可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，純化后可安全使用，體內(nèi)表達(dá)周期可達(dá)4周。（科研、臨床應(yīng)用最廣泛，一般常用Ad5型腺病毒）第二代腺病毒載體：一般將E2A或E4基因缺失的腺病毒載體成為二代載體。產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較弱，其安全性和載體容量有所改進(jìn)，但病毒包裝難度和出毒滴度下降厲害，應(yīng)用局限。第三代腺病毒載體：缺失了全部的（無病毒載體等）或大部分腺病毒基因，僅保留ITR和包裝信號序列。這
4、一載體系統(tǒng)需要一個腺病毒突變體作為輔助病毒。腺病毒載體大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）為基礎(chǔ)重組系統(tǒng)由2種質(zhì)粒構(gòu)成：一、包含全部（或右側(cè)大部分）腺病毒基因組DNA的大質(zhì)粒，即骨架質(zhì)粒二、小的穿梭質(zhì)粒，其帶有目的基因的表達(dá)盒以及表達(dá)盒兩側(cè)的與大質(zhì)粒上的目的基因擬插入部位同源序列（左右臂）AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)腺病毒粒子相對穩(wěn)定，插入外源基因的病毒基因組在連續(xù)傳代中保持不變，易于用重組DNA技術(shù)操作?？赊D(zhuǎn)入分裂后的非分裂細(xì)胞中發(fā)揮作用，可以感染處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞?？山?jīng)不同途徑進(jìn)入不同組織(可以在
5、腸道內(nèi)繁殖，也可以在呼吸道內(nèi)繁殖。改建腺病毒基因部分缺失載體的克隆容量可達(dá)10kb，腺病毒基因完全缺失載體克隆容量可達(dá)37kb。無需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，目的基因在宿主細(xì)胞基因組外游離狀態(tài)下表達(dá)，整合突變致癌可能性小。穩(wěn)定性高宿主范圍廣感染性強(qiáng)包裝容量大安全性好幾種病毒載體的區(qū)別腺病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒基因組組成雙鏈DNA單鏈RNA單鏈DNA載體容量<8kb<8kb<6kb基因整合功能無，病毒基因組游離于宿主基因組之外，瞬時表達(dá)外源基因有，病毒基因組整合到宿主基因組，長時間、穩(wěn)定
6、表達(dá)外源基因有表達(dá)豐度高水平表達(dá)中中表達(dá)時間快（1-2天）慢（2-4天）快（1-2天）感染細(xì)胞類型分裂和不分裂細(xì)胞分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞分裂cell，但在干細(xì)胞中表達(dá)效率低滴度U/ml1012109109四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)不可以TET-ON,TET-OFF不可以毒性作用細(xì)胞毒性遺傳毒性遺傳毒性腺病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒免疫原性高免疫原性低免疫原性低動物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物可以，但很難安全系數(shù)高高中能否用于miRNA可以可以不可以RNAi病毒進(jìn)入細(xì)胞往往引起細(xì)胞內(nèi)
7、干擾素反應(yīng)，不適合做RNAi實(shí)驗(yàn)適合，是優(yōu)選工具可以基因過表達(dá)包裝容量大，可以滿足較大基因的包裝，是過表達(dá)基因的優(yōu)選工具包裝容量有限，過表達(dá)的基因過大時病毒滴度受到影響包裝容量有限，過表達(dá)的基因過大時病毒滴度受到影響常見應(yīng)用1、體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)2、基因治療同上體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，突變篩選，功能基因庫構(gòu)建謝謝觀看！2020
