抗菌藥物敏感性試驗及細(xì)節(jié)耐藥檢測.doc

《抗菌藥物敏感性試驗及細(xì)節(jié)耐藥檢測.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、抗菌藥物敏感性試驗與細(xì)節(jié)耐藥性監(jiān)測來源：檢驗醫(yī)學(xué)在線2009-4-15南網(wǎng)編輯2010-7-6一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗(一)紙片瓊脂擴(kuò)散法紙片瓊脂擴(kuò)散法又稱Kirby-Bauer試驗，是操作最簡易、使用最廣泛的抗菌藥物敏感性試驗。1．試驗原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈越大，MIC

2、越小。2．培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片(1)培養(yǎng)基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培養(yǎng)基是CLSI/NCCLS采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH值為7.2～7.4，對那些營養(yǎng)要求高的細(xì)菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需加入補充物質(zhì)。瓊脂厚度為4mm。配制瓊脂平板當(dāng)天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前應(yīng)將平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。(2)抗菌藥物紙片：選擇直徑為6.35mm，吸水量為20ul的專用藥敏紙片用逐片加樣或浸泡方法使每片含量達(dá)到規(guī)定所示。含藥紙片密封儲存2～8℃或-20℃無霜冷凍箱內(nèi)保存，β-內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍

3、儲存，且不超過l周。使用前將儲存容器移至室溫平衡l～2h，避免開啟儲存容器時產(chǎn)生冷凝水。3．細(xì)菌接種細(xì)菌接種采用直接菌落或細(xì)菌液體生長方法。用0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度。校正濃度后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種完畢。接種步驟如下：①用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂片接種3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；②平板置室溫下干燥3～5min，用紙片分離器或無菌鑷將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后閱讀結(jié)果，對甲氧西林和萬古霉素藥敏感試驗結(jié)果應(yīng)孵育24h。4．結(jié)果判斷和報告用精確度為1mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌

4、圈直徑(抑菌圈的邊緣應(yīng)是無明顯細(xì)菌生長的區(qū)域)，當(dāng)葡萄球菌對苯唑西林的藥敏試驗或腸球菌對萬古霉素的敏感試驗，圍繞紙片周圍只要有極少細(xì)菌生長提示為耐藥。對另外一些菌，在抑菌圈內(nèi)散在菌落生長提示可能是混合培養(yǎng)，必須再分離鑒定及試驗，也可能提示為高頻突變株。變形桿菌遷徙生長使抑菌圈內(nèi)生成的薄層菌可忽略不計。由于培養(yǎng)基內(nèi)抗藥成分使其對甲氧芐啶引起的輕微細(xì)菌生長，生長層小于20％可忽略不計。根據(jù)CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，對量取的抑菌圈直徑判斷病原菌對該藥物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐藥)。(二)稀釋法如果要進(jìn)一步檢測某種病原菌對多少劑量(濃度)的抗菌藥物呈敏感時，就

5、必須使用稀釋法(dilutionmethod)。稀釋法包括兩種：肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，分別介紹如下：1．肉湯稀釋法有常量稀釋法(mac-rodilution)和微量稀釋法(microdilution)，前者含藥肉湯含量每管≥l.0ml(通常2m1)，后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀釋板上含有多種經(jīng)對倍系列稀釋的凍干抗生素，操作方便，廣泛應(yīng)用于臨床。(1)培養(yǎng)基：使用M-H肉湯，需氧菌、兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。在該培養(yǎng)液中加入補充基質(zhì)可支持流感嗜血桿菌、鏈球菌生長。培養(yǎng)基制備完畢后應(yīng)校正pH值為7.2～7.4(25℃)。離子校正的M-H肉湯(CAMHB)

6、為目前推薦的藥敏試驗培養(yǎng)液。(2)藥物稀釋①藥物原液制備：抗菌藥物直接購自于廠商或相關(guān)機(jī)構(gòu)，所需的溶液量或粉劑量可根據(jù)下述兩公式進(jìn)行計算。質(zhì)量(mg)=溶劑（ml）×濃度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）容積(m1)=質(zhì)量(mg)×分析效能（ug/mg）/濃度（ug/ml）配制各種抗菌藥物的溶劑根據(jù)藥物性能選擇蒸餾水、pH值為6.0，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液等。一般原液濃度不低于1000ug/ml或10倍于最高測試濃度，原液應(yīng)儲存于-60℃以下，保存期不超過6個月。②稀釋抗菌藥物的制備：行2倍系列稀釋，使其終濃度(ug/m1)為512、256、128、64、

7、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。(3)菌種接種：配制0．5麥?zhǔn)蠞舛染?，用肉?常量稀釋法)、蒸餾水或生理鹽水(微量稀釋法)稀釋菌液，使最終菌液濃度(每管或每孔)為5×105CFU／ml，稀釋菌液于15min內(nèi)接種完畢，35℃孵育16～20h，當(dāng)試驗菌為嗜血桿菌屬、鏈球菌屬孵育時間為20～24h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏試驗孵育時間必須滿24h以上。(4)結(jié)果判斷：以在試管內(nèi)或小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC(ug/m1)。甲氧芐啶(甲氧芐胺嘧啶)或磺胺藥物的肉湯稀釋法敏感試驗的終點判斷，以細(xì)菌數(shù)